Name: نقل الجينات إلى داخل الجهاز الدجاج السمعية التي كتبها في البيضة الصغرى Electroporation لل (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: تعلم تقنية التحويل الكهربائي الدقيق داخل البيضة لدراسة تكاثر وتمييز الخلايا السلفية السمعية في عضو السمع النامي للدجاج. هذه الطريقة تُسهّل التلاعب الجيني من اليوم الرابع للجنين.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر الدكتور دوريس ك وو لالبلازميدات التعبير وفي تحقيقات الموقع، ومركز جامعة جونز هوبكنز للمنشأة الأحياء التصوير الحسي ومركز السمع والتوازن. وأيد هذا العمل من قبل NIDCD غرانت T32 DC000023 جنيه

تتم رعاية البيض والأجنة لم يفقس لومعاملة أخلاقية وإنسانية. تمت الموافقة على جميع البروتوكولات للاستخدام الجنين لم يفقس من قبل رعاية الحيوان واستخدام اللجنة في كلية جونز هوبكنز للطب في بالتيمور بولاية ماريلاند. 1. البيض وإعداد التركيبات التعبير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيض: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 3-4 عشرات المخصبة بيض الدجاج (جالوس جالوس) الاستلقاء على جنوبهم عند 37 درجة مئوية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة من الحضانة، وسحب 3 سم مكعب من زلال مع حقنة من النهاية الخلفية وإيابا للبيضة واغلاق فتحة مع الشريط واضح. وهذا يخلق غرفة الهواء بين الجنين وقشر البيض، والسماح لسهولة الوصول إلى الجنين دون الجنين التمسك قذيفة عند قطع نافذة للوصول على أعلى من البيض 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 117 ساعة من وقت الحضانة، مرحلة الأجنة وفقا للهمبرغر وهاميلتون 20 مراحل النموفي E4 (HH24-25) (انظر الشكل 1D). </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بنيات التعبير: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد البلازميد باستخدام الكواشف وبروتوكول المقدمة من قبل الشركة المصنعة للإعداد ملف المتاحة تجاريا. في الخطوة الأخيرة من الإعداد، أزل الحمض النووي في 500 ميكرولتر TE (تريس، EDTA) العازلة المنصوص عليها في عدة في أنبوب 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الايثانول ترسيب الحمض النووي على التركيز من خلال إضافة 50 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم و 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى الأنبوب. وضع أنبوب في -20 درجة CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 14000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف والهواء الجاف بيليه لمدة 10 دقيقة في RT. حل بيليه في المخزن TE 15 ميكرولتر، والتي ينبغي أن تسفر عن تركيز ~ 4 ميكروغرام / ميكرولتر. ملاحظة: التحكم بنيات التعبير المستخدمة هنا هي pMES-IRES-GFP 10، التي يقودها المروج الدجاج β-الأكتين، أو PCI-H2B-IRES-طلب تقديم العروض <sتصل&gt; 10، التي يقودها المروج CMV. </li></ol></li></ol> 2. الدجاج في البيضة الصغيرة Electroporation للوفي البيضة تكاثر الخلايا الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في البيضة الصغيرة حقن تعبيد التعبير والصغرى Electroporation لل: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب أنابيب زجاجية الشعرية إلى إبر رفيعة باستخدام مجتذب ماصة الجزئي مع المعلمات الأمثل التالية ل2.5 × 2.5 ملم مربع البلاتين التدفئة الشعيرة: الضغط = 500، الحرارة = 600 ° C، سحب = 64، السرعة = 105، والوقت = 150 مللي ثانية (انظر الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد واليسارية ومراحل مناور الصغيرة اليد اليمنى المرافقة المجهر (انظر الشكل 1A). وتتلاعب الدقيقة اليد اليمنى يحمل الزجاج الشعرية الإبرة وتتلاعب الدقيقة أعسر يحمل أقطاب (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير الزجاج الشعرية إبرة سحب ناعما لحقن الجزئي عن طريق خفضغيض من الإبرة مع ملقط بينما تعمل تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شغل الإبرة يدويا باليد باستخدام مناور الصغير مع 2.5 ميكرولتر من البلازميد ملون مع 0.1٪ سريع الخضراء بينما كان يعمل تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع البيض ملقاة على جانبها داخل جهاز العفن / بيضة عقد (انظر الشكل 1A). قطع نافذة مستديرة حول الجزء العلوي من البيضة باستخدام مقص 19 (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما كان يعمل تحت المجهر، وفتح بعناية الأغشية اثنين تتراكب الجنين باستخدام ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما كان يعمل تحت المجهر، وتقديم ما يقرب من ~ 0.5 ميكرولتر من البلازميد إلى اليمين تجويف الحويصلة الأذنية عن طريق الحقن الصغيرة يدويا باستخدام اليد اليمنى باستخدام تتلاعب الدقيقة وElectroporation للالصغيرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للقيام بذلك، والصغرى حقن الأيمن تجويف الحويصلة الأذنية مع الحمض النووي مع اليد اليمنى الدقيقة مناور (الشكل 1B-D) في الوقت نفسه باستخدام على holdin الأيسرالجا forcep لتحقيق استقرار رأس الجنين، لأن رأس الجنين الانخفاضات في مرحلة E4. لا الجزئي حقن-الماضي تجويف الحويصلة الأذنية، لأن هذا سيضر الحويصلة الأذنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد الحقن الصغيرة، بينما كان يعمل تحت المجهر، واستخدام اليسار اليد الصغيرة مناور لوضع إيجابي (الأنود) 2 مم البلاتين القطب الأمامي بطني إلى الحويصلة الأذنية اليمنى والسلبية القطب 2 مم (الكاثود) بالتوازي 1 مم وبصرف النظر (انظر الشكل 1 C). تسليم 4 البقول بنسبة 12 V مع 100 ميللي ثانية مدتها و 200 تباعد مللي ثانية. تخدم الحويصلة الأذنية ترك كعنصر تحكم غير المعالجة الداخلية. ملاحظة: تنظيف الأقطاب بين electroporations مع مسحة ذات الرؤوس القطن مغموسة في برنامج تلفزيوني 1X. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في البيضة تكاثر الخلايا الفحص: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد Electroporation للإضافة 50 ميكرولتر من 0.25 ملغ / مل ايدو في برنامج تلفزيوني 1X بإسقاط EDU حل 50 ميكرولتر يدويا على وجه العمومالجنين في البيضة باستخدام ماصة. ختم البيض مع الشريط والعودة إلى الحاضنة لمدة 18-96 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية إزالة الشريط والتحقق من الأجنة لGFP الفلورسنت أو إشارة طلب تقديم العروض داخل الحويصلة الأذنية بعد 18 - 24 ساعة باستخدام المجهر الفلورسنت القياسية (انظر الشكل 1 EE). إذا إشارة الفلورسنت الحالية، في هذه المرحلة حصاد الأجنة للتحليلات أو ختم مع الشريط وإعادته إلى حاضنة للحصاد والتحليلات في مراحل لاحقة (انظر الشكل 1 FP &#39;&#39;). ملاحظة: التعبير عن إشارة GFP مع بناء pMES-IRES-GFP هو واضح 6-7 ساعة بعد Electroporation لل10. </li></ol></li></ol> حصاد 3. الأجنة ومعالجة الأنسجة لRNA في الموقع التهجين والمناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الأجنة باستخدام ملقط. شطف الجنين في 1X PBS الباردة. إزالة رؤوس الأجنة، عن طريق قطع الرأس عنقهباستخدام ملقط، ووضع رؤساء إلى 4٪ امتصاص العرق O / N عند 4 درجات مئوية. ثقب الدماغ باستخدام forcep للسماح للتغلغل في امتصاص العرق 4٪ داخل الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى رؤساء في 30٪ سكروز (في برنامج تلفزيوني 1X) O / N عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل رؤساء في وسط واق من البرد قبل التجميد السريع في الطين من الثلج الجاف وmethylbutane (2-Methylbutane). بدلا من ذلك، سريعة تجميد رؤساء في وسط واق من البرد مع النيتروجين السائل. تخزين رؤساء شنت في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryosection رؤساء إلى 12 ميكرومتر أقسام الأنسجة السميكة وجمع كل أقسام الأنسجة التي تحتوي على الأذن الداخلية على شرائح المجهر الزجاجية superfrosted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء RNA القياسية في الموقع التهجين والمناعية كما هو موضح سابقا 4،21، وتحليل لتكاثر الخلايا ايدو بعد بروتوكول المقدمة من قبل الشركة المصنعة للمجموعة. ملاحظة: يمكن التعرف على خلايا الشعر باستخدام الأرنب بولكلونل α-MyosinVIIa (Myo7a) لtibody (1: 1000، بروتيوس العلوم البيولوجية) والضد الثانوية fluorescently المسمى (1: 250، الماعز المضادة للأرنب AlexaFluor 488؛ إينفيتروجن). </li></ol> 4. التقاط الصور والمعالجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صور مع معدات التصوير الرقمية. النتائج صورة المناعية مع المجهر ونتائج في الموقع باستخدام المجهر واسعة المجال القياسية (التي تتراوح بين 5X إلى 40X في التكبير) الفلورسنت القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معالجة الصور باستخدام برامج معالجة الصور. </li></ol>

<ol><li>Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+atlas+of+the+gross+anatomy+of+the+developing+inner+ear+of+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken.</a> The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).</li>
<li>Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Patterning of the mammalian cochlea.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).</li>
<li>Whitfield, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Development of the inner ear.</a> Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).</li>
<li>Raft, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-regulation+of+Ngn1+and+Math1+coordinates+the+production+of+neurons+and+sensory+hair+cells+during+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development.</a> Development. 134, 4405-4415 (2007).</li>
<li>Satoh, T., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+the+relationships+between+mechanosensory+cells+and+the+neurons+that+innervate+them+in+the+chicken+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear.</a> Development. 132, 1687-1697 (2005).</li>
<li>Katayama, A., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+production+in+the+chicken+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Cell production in the chicken cochlea.</a> The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).</li>
<li>Cotanche, D. A., Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+stereociliary+bundles+in+the+cochlear+duct+of+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos.</a> Brain Res. 318, 181-193 (1984).</li>
<li>Alsina, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+is+required+for+determination+of+otic+neuroblasts+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo.</a> Developmental biology. 267, 119-134 (2004).</li>
<li>Chang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp4+is+essential+for+the+formation+of+the+vestibular+apparatus+that+detects+angular+head+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements.</a> PLoS genetics. 4, e1000050(2008).</li>
<li>Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+neurogenesis+in+the+inner+ear+requires+inhibition+of+Sox2+transcription+by+neurogenin1+and+neurod1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).</li>
<li>Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2-mediated+gene+transfer+and+in+ovo+electroporation+of+the+otic+placode%3A+a+powerful+and+versatile+approach+for+investigating+embryonic+development+and+regeneration+of+the+chicken+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear.</a> Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).</li>
<li>Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Id+gene+regulation+and+function+in+the+prosensory+domains+of+the+chicken+inner+ear%3A+a+link+between+Bmp+signaling+and+Atoh1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).</li>
<li>Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+Sox2+and+Sox3+in+neuronal+and+sensory+progenitors+of+the+developing+inner+ear+of+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick.</a> The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).</li>
<li>Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prosensory+function+of+Sox2+in+the+chicken+inner+ear+relies+on+the+direct+regulation+of+Atoh1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1.</a> PLoS One. 7, 30871(2012).</li>
<li>Das, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental biology. 294, 554-563 (2006).</li>
<li>Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+neural+crest+cell+alphaN-catenin+impacts+chick+trigeminal+ganglia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation.</a> Developmental biology. 392, 295-307 (2014).</li>
<li>Kumar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+non-small+cell+lung+tumor+development+by+the+let-7+microRNA+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).</li>
<li>Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf+signaling+regulates+development+and+transdifferentiation+of+hair+cells+and+supporting+cells+in+the+basilar+papilla%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla.</a> Hearing research. 289, 27-39 (2012).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , e306(2007).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+bone+morphogenetic+proteins+in+the+developing+vestibular+and+auditory+sensory+organs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).</li>
<li>Bell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+segregation+of+auditory+and+vestibular+neurons+in+the+otic+placode%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode.</a> Developmental biology. 322, 109-120 (2008).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

تم تحسين طريقة هنا وصف للفي البيضة Electroporation للالصغيرة للنقل الجينات في الجهاز السمعي النامية. وهو متوافق مع البلازميد ناقلات التعبير المعتمدة على الحمض النووي عادة ما تستخدم للتلاعب وظيفة الجين / التعبير. توقيت Electroporation للفي E4 هو الأمثل للتحقيقات التي تركز على التنمية HC في الجهاز السمعي. الخطوات الأكثر أهمية والصغيرة عن طريق الحقن، والحمض النووي في تجويف الحويصلة الأذنية دون الذهاب عميقة جدا مع الإبرة وإلحاق أضرار الحويصلة الأذنية (انظر الشكل 1A-D)...

وعلى الرغم من الاختلافات في الشكل والزخرفة الخلوية بين الثدييات والطيور الجهاز الحسي السمعي، ويعتقد أن العوامل الجزيئية ومسارات المسؤولة عن التنمية HC الحسية يجب الحفاظ تطويريا 1-3. حليمة القاعدي، الذي يضم المراكز الصحية السمعية والمنبوذة المحيطة بها، ويطور باعتبارها تجيب خارجي من الكيسة السمعية في الاذن الداخلية. في وقت مبكر على مجموعة من الأسلاف HC وSC المحدد ضمن اللوحاء أذني / أذني نطاق المختصة كوب العصبية الحسية (إس دي). توفر البيانات مصير رسم خرائط دليل على أن الأنساب العصبية والحسية ترتبط وتنشأ من NSD تقع في منطقة انتيرو بطني من الكأس أذني أو الكيسة السمعية في الفئران والدجاج 4،5. أولا، neuroblasts delaminate من NSD تثير الخلايا العصبية من العقدة-السمعية الدهليزي، الذي انشق في نهاية المطاف إلى العقد السمعي والدهليزي. هذه الخلايا العصبية يعصب المراكز الصحية الحسية في الأذن ونوى الداخلية في الدماغ. الخلايا عشرفي البقاء في مديرية الأمن القومي ويعتقد أن تثير مختلف بقع الحسية، بما في ذلك الجهاز الحسي السمعي، ويتألف من المراكز الصحية الحسية transducing والميكانيكية والمنبوذة المرتبطة بها. في كل فرخ والفئران، الجهاز السمعي الحسي السلف خروج دورة الخلية وHC التمايز يحدث في معارضة التدرجات. في الفرخ، السلف السمعي-دورة الخلية خروج يبدأ حول ~ E5 وتقدم من القاعدة إلى القمة، ومن المركز إلى المحيط 6. في وقت لاحق يوم واحد، يبدأ HC التمايز في قمة وتقدم إلى قاعدة 7. دراسة تطوير الأذن الداخلية في الدجاج يوفر العديد من المزايا التقنية كما يمكن التحقيق الآليات الوظيفية مع السهولة النسبية في البيضة بدلا من التلاعب الأجنة في الرحم في نظم نموذج أخرى، الأمر الذي يتطلب عملية جراحية معقدة. الطريقة الموصوفة هنا يستخدم في البيضة Electroporation للالجزئي لاستهداف الجينات في المصالح في باسيلا الظنيص منطقة حليمة الأمامي-البطني في الحويصلة الأذنية على وجه التحديد في E4. Electroporation للفي البيضة هو الاسلوب الذي راسخة وتستخدم عادة 8-14. ويستند مبدأ أسلوب Electroporation للفي حقيقة أن النيوكليوتيدات (على سبيل المثال، البلازميد، الحمض النووي الاصطناعي، أو الحمض النووي الريبي [أليغنوكليوتيد) واتهم سلبا. يتم حقن الحمض النووي في الأنسجة من الاهتمام. عندما يتم وضع التيار الكهربائي في جميع أنحاء الأنسجة، والتيار يفتح مسام عابرة في جدران الخلايا ويسمح لامتصاص الحمض النووي، كما يتدفق الحمض النووي سالبة الشحنة نحو القطب الموجب (الأنود). للتجارب مكاسب من وظيفة، وsubcloned جينات الفائدة عادة إلى التعبير البلازميدات التي تحتوي على أشرطة التعبير المناسبة للبروتين أخضر فلوري (GFP) أو بروتين أحمر فلوري (RFP). لفقدان وظيفة من التجارب القائمة على البلازميد المهيمنة يبني السلبية كاظمة، أو رني، أو يبني morpholino هم جتستخدم ommonly 15،16. لمنع الرنا الميكروي (ميرنا) وظيفة miRNAs يبني الاسفنج، التي عادة ما تكون البلازميد مقرها، ويمكن استخدامها 17. يسمح الطريقة هنا وصف للتحقيق في الآليات الجزيئية التي تتحكم في انتشار والتمايز في الجهاز السمعي، كما في البيضة طريقة Electroporation للالصغيرة يمكن الجمع بسهولة مع البيضة في فحص تكاثر الخلايا بإضافة EDU إلى الجنين كله. يتم تنفيذ Electroporation للوإضافة ايدو في E4 في الحويصلة الأذنية، الذي هو قبل يوم واحد من بداية خروج دورة الخلية في الجهاز السمعي. تحليل الجهاز السمعي هو عادة يؤديها 18-96 ساعة بعد Electroporation للفي E5 (بداية من السلف الحسي خروج دورة الخلية)، E6 (بداية التمايز HC)، وE7 (خلال التمايز HC)؛ وفي وقت لاحق إلى ~ E9 (نهاية التمايز HC). هذه الطريقة Electroporation للنقل الجين هو عابر دائم تقريبا ~ 4 أيام، becau حدحد ذاته جينات الفائدة لا الاندماج في الجينوم، ولكن الأسلوب هو المعمول به للاستخدام مع البلازميد المناسب ناقلات التعبير المعتمدة على الحمض النووي، التي لا تملك القدرة على الاندماج في الجينوم، مثل نقل الجينات بوساطة Tol2-11. مع هذا الأسلوب GFP قوي أو التعبير طلب تقديم العروض يستمر ~ 4 أيام في القوقعة، وبعد ذلك نشير إشارات تتلاشى، بعد توفير نافذة متسع من الوقت لدراسة تطوير معقدة من الجهاز السمعي. هذا في البيضة طريقة نقل الجينات هي رواية ويسمح خصيصا لاستهداف الجهاز السمعي المفترض في E4، الذي هو الأمثل للتحقيقات التي تركز على التنمية HC في الجهاز السمعي. بل هو إضافة جيدة إلى الطرق البديلة، التي electroporate في مراحل نمو أصغر من ذلك بكثير 11،12 أو بالمقارنة مع استخدام في المختبر الحليمات القاعدي الثقافات يزدرع 18.

<table><tbody><tr><td>معقم 1x PBS درجة الحموضة 7.4</td><td>gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>مسحوق FCF أخضر سريع</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>EdU مسحوق</td><td>Invitrogen</td><td>E10187</td><td></td></tr><tr><td>Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10338</td><td></td></tr><tr><td>HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)</td> <td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 ElectroSquarePorator&nbsp;</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banana to Micrograbber Cable Kit</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>اليد اليمنى & amp المعالجات الدقيقة اليسرى</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>M3301R & M3301L</td><td></td></tr><tr><td>مرحلتان من جهاز القابضة المغناطيسي مقاس 12 مم مع أعمدة عمودية مقاس 7 بوصات</td><td>World Precision Instruments Inc. &nbsp ؛</td>لوحة قاعدة فولاذية <td>معدنية M10</td><td></td></tr><tr><td>مقاس 12 × 24 بوصة</td> شركة <td>World Precision Instruments Inc. &nbsp ؛</td><td>5479</td><td></td></tr><tr><td>مقص للبيض بطول 12 سم منحني ، شفرات متناهية الصغر 12 مم ؛ مقص الربيع</td><td>العالمية للأدوات الدقيقة Inc.&nbsp;</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>مجتذب Micropippette لسحب الإبر</td> شركة <td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>2.5x2.5 مم صندوق البلاتين التدفئة خيوط</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>أنابيب زجاجية شعرية / إبر / بدون ألياف / بوروسيل 1 مم</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td></td></tr><tr><td>حقنة زجاجية هاميلتون 100 مو ؛ ل</td><td>زيت معدني هاميلتون</td><td>80601 موديل 710LT</td><td></td></tr><tr><td>(ثقيل) لحقنة زجاجية هاميلتون</td><td>فيشر Scientific</td><td>O122-1</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب البولي إيثيلين لتوصيل المحقنة الزجاجية والإبر الشعرية الزجاجية /</td><td>بيكتون ديكنسون وشركاه غير السامة (BD)</td> <td>427420 Intramedic Clay Adams Brand</td><td></td></tr><tr><td>3 cc محاقن يمكن التخلص</td><td>منها Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>يمكن التخلص منها 21 إبر</td><td>قياس Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>زوج واحد من الأقطاب الكهربائية البلاتينية مقاس 2 مم</td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY611P3-2</td><td></td></tr><tr><td>حامل القطب الكهربائي</td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY580</td><td></td></tr><tr><td>زوج واحد من ملقط Dumont الناعم رقم 5</td><td>أدوات العلوم الدقيقة (FST) شريط</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>غير مرئي غير لامع لختم البيض</td><td>مكتب ديبوت</td><td>520-928</td><td></td></tr><tr><td>مسحات قطنية ذات رؤوس</td><td>فيشر Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr>نصائح <td></td><td></td><td></td><td>مرشح معقمة</td></tr></tbody></table>

نقل الجينات إلى داخل الجهاز الدجاج السمعية التي كتبها<em&gt; في البيضة</em&gt; الصغرى electroporation لل

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

أجنة الدجاج هي أنظمة النموذج المثالي لدراسة التطور الجنيني كما يمكن إجراء التلاعب وظيفة الجين مع السهولة النسبية في البيضة. الأذن الداخلية السمعي الجهاز الحسي هو أمر حاسم لقدرتنا على الاستماع. ويضم ظهارة متخصصة للغاية الحسية التي تتكون من خلايا الشعر transducing والميكانيكية (المراكز الصحية) والمحيطة الدبقية مثل الخلايا الداعمة (المنبوذة). وعلى الرغم من الاختلافات الهيكلية في أجهزة السمع، الآليات الجزيئية التي تنظم تطوير الجهاز السمعي يتم حفظها تطويريا بين الثدييات وأفيس electroporation في البيضة محدودة إلى حد كبير في المراحل المبكرة في E1 - E3. نظرا للتطور في وقت متأخر نسبيا من الجهاز السمعي في E5، التلاعب من الجهاز السمعي بواسطة electroporation في البيضة الماضي E3 صعبة نتيجة لتطور متقدمة من الجنين الدجاج في مراحل لاحقة. الطريقة المعروضة هنا هي طريقة نقل الجينات عابرة لاستهداف الجينات في المصالح فيمرحلة E4 - E4.5 في تطوير السمعية الدجاج الجهاز الحسي عبر في البيضة-Electroporation للالصغرى. هذا الأسلوب ينطبق على gain- والخسارة من وظائف مع البلازميد التقليدية ناقلات التعبير المعتمدة على الحمض النووي ويمكن الجمع بين في البيضة مقايسة انتشار الخلايا بإضافة ايدو (5 إيثينيل-2&#39;-deoxyuridine) إلى الجنين كله في وقت Electroporation لل. استخدام أخضر أو ​​أحمر بروتين فلوري (GFP أو طلب تقديم العروض) البلازميدات التعبير يسمح للمجرب لتحديد بسرعة ما إذا كان Electroporation للاستهدفت بنجاح الجزء السمعي في الأذن الداخلية النامية. في هذه الورقة الطريقة، يتم توضيح الأمثلة النموذجية على GFP electroporated العينات. وكان حصاد الأجنة 18-96 ساعة بعد Electroporation للواستهداف GFP إلى منطقة موالية للالحسية للجهاز السمعي ما أكده الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين. ويقدم ورقة الأسلوب أيضا على بروتوكول الأمثل لاستخدام الثيميدين التناظرية ايدو لتحليل prolif خليةeration. وتقدم مثالا للمقايسة انتشار الخلايا EDU على أساس أن يجمع المناعية وضع العلامات وانقر EDU الكيمياء.

في هذا الحمض النووي طريقة رقة البلازميد التي تتكون من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) أشرطة التعبير استهدف في الدجاج تطوير حليمة القاعدي (BP) مع المعلمات الأمثل من 12 فولت و 4 البقول مع 100 مدة النبضة ميللي ثانية وفترات من 200 ميللي ثانية، مما أسفر عن ~ 50٪ معدل البقاء على قيد الحياة الجنين والكفاءة البلازميد الحمض النووي تستهدف في BP. وأظهر التصوير فلوري التعبير GFP الأصلي في تطوير الأجنة هذا الأسلوب من Electroporation لليستهدف بشكل تفضيلي الجانب ال...

يتوسط العضو السمعي السمع. نقدم هنا طريقة معدلة في التكوين الكهربائي الدقيق في البيضا المحسنة لدراسة تكاثر الخلايا السلفية السمعية والتمايز في العضو السمعي النامي للدجاج.

نقل الجينات إلى داخل الجهاز الدجاج السمعية التي كتبها<em&gt; في البيضة</em&gt; الصغرى Electroporation لل

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

الهدف العام من هذه الطريقة هو إجراء تلاعبات جينية في الجهاز السمعي النامي للدجاج بدءاً من اليوم الرابع من التطور الجنيني فصاعداً. وتكمن أهمية ذلك في صعوبة العمل مع المراحل التطورية المتقدمة للجنين في الدجاج. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تستهدف تحديداً الجهاز السمعي النامي داخل البيضة (in ovo) بسهولة نسبية مقارنة بالتقنيات الأخرى التي تتطلب جراحات معقدة داخل الرحم (in utero).يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية حول التطور الحسي السمعي، بما في ذلك كيفية تنسيق النمط المكاني والزمني لتكاثر الخلايا السلفية الحسية وتمايزها الوراثي. لبدء هذا الإجراء، قم بتثبيت إبرة الشعيرة الزجاجية باستخدام الأنبوب المتصل بالمحقنة الزجاجية الموضوعة على المجهر المناور (micromanipulator) الأيمن، وضع الأقطاب الكهربائية على المجهر المناور الأيسر.باستخدام المجهر، قم بقطع طرف الإبرة بواسطة ملقط. بعد ذلك، ضع 2.5 µL من DNA البلازما المصبوغ بـ 0.1% fast green في طبق. املأ الإبرة بـ DNA البلازما باستخدام مكبس المحقنة المتصل بالمتلاعب الدقيق الموجود على الجانب الأيمن.ضع بيضة على جانبها في جهاز تثبيت. بعد ذلك، قم بقص نافذة مستديرة في الجزء العلوي من البيضة باستخدام مقص. ثم، ضع البيضة في جهاز التثبيت تحت المجهر.افتح الغشائين اللذين يغطيان الجنين بعناية باستخدام ملقط لكشف الحويصلة الأذنية اليمنى. وأثناء تثبيت رأس الجنين بالملقط باستخدام اليد اليسرى، قم بحقن حوالي 0.5 µL من الحمض النووي للبلازما (plasma DNA) بواسطة المجهر المتلاعب الدقيق (micromanipulator) باليد اليمنى. كن حذرًا من عدم الحقن بعد تجويف الحويصلة الأذنية لأن ذلك سيؤدي إلى تلف الحويصلة الأذنية.يعد الحقن المجهري للحمض النووي DNA في تجويف الحويصلة الأذنية دون إتلافها أمراً بالغ الأهمية ويتطلب استخدام كلتا اليدين. مباشرة بعد الحقن المجهري، استخدم أداة التحكم الدقيقة في اليد اليسرى لوضع مجموعة أقطاب البلاتين الموجبة والسالبة بحجم 2 ملم في المنطقة البطنية الأمامية للحويصلة الأذنية اليمنى، ثم قم بتوجيه أربع نبضات بجهد 12 فولت عن طريق تشغيل جهاز التثقيب الكهربائي. إن الوضع الدقيق للأقطاب الكهربائية على منطقة العضو السمعي المفترضة في الناحية البطنية الأمامية أمر مهم لضمان استهداف العضو السمعي النامي.مباشرة بعد عملية التثقيب الكهربائي، أضف 50 µL من EdU على الجنين كاملاً داخل البيضة (in ovo). بعد ذلك، أغلق البيضة باستخدام الشريط اللاصق. أعِد جميع البيوض التي تم التعامل معها وإغلاقها إلى الحاضنة لمدة تتراوح من 18 إلى 96 ساعة.بعد مرور 18 إلى 24 ساعة، قم بإزالة الشريط بعناية. افحص الأجنة للتحقق من وجود إشارة GFP أو RFP الفلورية داخل الحويصلة الأذنية باستخدام مجهر فلوري قياسي. في حال وجود إشارة فلورية، يتم جمع الأجنة لإجراء التحليلات، أو يتم إعادة إغلاقها بالشريط وإعادتها إلى الحاضنة لجمعها وتحليلها في مراحل لاحقة.استُخدم التهجين الموضعي للحمض النووي الريبي (RNA in situ hybridization) لتحديد ما إذا كان التثقيب الكهربائي قد استهدف بنجاح الجزء السمعي من الأذن الداخلية النامية. وضمن الصفيحة القاعدية (BP) النامية، تم التعرف على السلائف الحسية من خلال تعبيرها عن Sox2 و Lunatic Fringe. وتوضح هذه الصور أن السلائف الحسية في جميع أنحاء الصفيحة القاعدية النامية عند القاعدة والقمة قد استُهدفت بنجاح وعبرت عن GFP بعد 68 ساعة من التثقيب الكهربائي.بالإضافة إلى ذلك، تم التعبير عن GFP خارج النطاق الحسي في الخلايا الظهارية غير الحسية وفي العقدة السمعية التي تميزها تعبيرات Neurod1. ولتحديد السلوك التكاثري للأسلاف الحسية، تمت إضافة EdU، وهو نظير للثيميدين، في وقت التثقيب الكهربائي في اليوم الجنيني الرابع (E4)، وبعد أربعة أيام، تم تحليل دمج EdU في البقعة الزرقاء (BP) النامية في مقاطع نسيجية. واستُخدم الوسم المناعي لبروتين Myosin7a النوعي للخلايا الشعرية لتحديد الخلايا الشعرية المتمايزة في البقعة الزرقاء (BP) النامية. وفي الجزء القمي من البقعة الزرقاء (BP)، كانت الخلايا الشعرية الموجبة لـ Myo7a موجبة لـ EdU في كثير من الأحيان.بينما في القاعدة، دمج عدد قليل فقط من الخلايا الشعرية الإيجابية لـ Myo7a مادة EdU، مما يشير إلى أنه في وقت إضافة EdU عند اليوم الرابع من التطور الجنيني (E4)، تكون الخلايا السلفية الحسية في القاعدة قد أصبحت في الغالب بعد انقسامية. بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون خمس إلى ثماني دقائق لكل بيضة. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم استخدام كواشف معقمة ومحضرة حديثًا لضمان بقاء الأجنة على قيد الحياة.بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تعديل معايير الطريقة لدراسة ظواهر أخرى في الأذن الداخلية النامية، مثل تطور الأعضاء الدهليزية وتكوين الخلايا العصبية في الأذن الداخلية. وتمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأذن الداخلية لدراسة العضو السمعي للدجاج، الذي يتطور في مرحلة متأخرة نسبياً، بدءاً من اليوم الجنيني الرابع فصاعداً. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعامل المناسب مع جنين الدجاج، وإجراء الحقن المجهري والتثقيب الكهربائي، وتنفيذ مقايسة تكاثر الخلايا داخل البيضة (in ovo).

gene-transfer-into-chicken-auditory-organ-ovo-micro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

فرخ في electroporation البيضة هو الأسلوب الذي يسمح التلاعب الجيني للجنين الطيور. التطبيقات الشائعة لهذه التقنية تشمل تحليل وظيفي من الجينات وعناصر محسن المفترضة. هذا الفيديو يوضح العصبية electroporation أنبوب في الأجنة سمو الفرخ 10. وتناقش تقنية الحقن والتعامل السليم البيض.

Electroporations OVO في مرحلة الجنين سمو الدجاج 10

الأذن الداخلية الماوس هي جهاز اللوحاء المستمدة من الحواس التي التنموية البرنامج وضعت خلال فترة الحمل. نحن...

نقل الجينات إلى الأذن الداخلية عن طريق تطوير ماوس<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; Electroporation

الهدف العام من هذا الفيديو هو إظهار كيفية تنفيذ حقن الشبكية المستهدفة...

في Electroporation OVO في شبكية العين الفرخ الجنينية

لتقييم وظيفة وتنظيم الجينات خلال تطوير الخلايا العصبية الدوبامين المخ الأوسط، ونحن تصف الأسلوب الذي...

في Electroporation البيضة في الدماغ المتوسط ​​الفرخ لدراسة وظيفة الجينات في الخلية العصبية الدوبامين التنمية

وصفت وهناك طريقة لنقل الجينات إلى أجنة الدجاج في مراحل الحضانة في وقت لاحق (أقدم من هامبورغ وهاملتون مرحلة (سمو) 22). هذا الأسلوب يتغلب على...

نقل الجينات في أجنة الدجاج أقدم من قبل<em&gt; OVO السابقين</em&gt; Electroporation

نقدم طريقة تصف عزل واستزراع استنخاذ القوقعة الصناعية من الأذن الداخلية للفأر الجنينية.  نوضح أيضا طريقة لنقل الجينات إلى مستخلصات القوقعة الصناعية عبر التثقيب الكهربائي ذو الموجة المربعة. تمكن ثقافة الزرع في المختبر إلى جانب تقنية نقل الجينات الباحثين من دراسة تأثيرات تغيير التعبير الجيني أثناء التطوير.

ثقافة الجنينية الماوس القوقعة إإكسبلنتس وجين نقل من قبل Electroporation لل

الخلايا العصبية السمعية الدماغية من الطيور والثدييات هي متخصصة في الترميز العصبي السريع، عملية أساسية لوظائف السمع العادية. تنشأ هذه الخلايا العصبية من السلائف متميزة من الدماغ المؤخر الجنيني. نقدم تقنيات الاستفادة إليكتروبوراتيون للتعبير عن الجينات في الدماغ المؤخر من أجنة الدجاج لدراسة وظيفة الجينات خلال التنمية السمعية.

في أوفو إليكتروبوراتيون في الدماغ الدماغ السمعي

لقد طورنا نهجا جديدا لفقدان الوظيفة يتضمن إدخال تسلسل الحمض النووي الريبي الدقيق الاصطناعي ودمجه الجينومي في أجنة الفرخ باستخدام التثقيب الكهربائي في البويضات ونظام ترانسبوزون Tol2. توفر هذه التقنية منهجية قوية ومستقرة لضربة قاضية للجينات لدراسات وظيفة الجينات أثناء التطوير.

نهج فقدان الوظيفة في شبكية العين الجنينية باستخدام التعبير الوراثي بوساطة Tol2 transposon للحمض النووي الريبي الدقيق الاصطناعي

الفرخ هو كائن نموذجي فعال من حيث التكلفة ويمكن الوصول إليه ومتاح على نطاق واسع لمجموعة متنوعة من الدراسات. هنا ، يتم تفصيل سلسلة من البروتوكولات لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور الأذن الداخلية للطيور وتجديدها.

في طرق Ovo و Ex Ovo لدراسة تطور الأذن الداخلية للطيور

باستخدام التثقيب الكهربائي للبويضات ، ابتكرنا طريقة لنقل الأذن الداخلية السمعية ونواة القوقعة بشكل انتقائي في أجنة الدجاج لتحقيق ضربة قاضية خاصة بمجموعة الخلايا لبروتين التخلف العقلي X الهش خلال فترات منفصلة من تجميع الدائرة.

تشريح وظيفة الخلية المستقلة لبروتين التخلف العقلي X الهش في دائرة سمعية بواسطة التثقيب الكهربائي في Ovo

تعلم تقنية التحويل الكهربائي الدقيق داخل البيضة لدراسة تكاثر وتمييز الخلايا السلفية السمعية في عضو السمع النامي للدجاج. هذه الطريقة تُسهّل التلاعب الجيني من اليوم الرابع للجنين.

نقل الجينات إلى داخل الجهاز الدجاج السمعية التي كتبها

استكشف المزيد من الفيديوهات