بروتوكول تصوير الإشعاع الذاتي مستقبلات للالتصور المترجمة من أنجيوتنسين الثاني المستقبلات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد تعبير مستقبلات الأنجيوتنسين II تشريحيا وتحديده في أقسام الدماغ باستخدام التصوير الشعاعي الذاتي للمستقبلات والتحديد النسيجي لهياكل الدماغ. تحدد هذه الطريقة مناطق الدماغ التي يؤثر فيها الأنجيوتنسين الثاني على السلوك والوظيفة المعرفية ونظام القلب والأوعية الدموية مما يوفر رؤى لتطوير علاجات جديدة لعلاج الأمراض التنكسية العصبية وأمراض القلب والأوعية الدموية. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها كمية ونوعية وتسمح بتحديد المستقبلات الوظيفية للأنجيوتنسين II بخصوصية أكبر من الطرق الأخرى.

هذه الطريقة يمكن أن تميز أيضا وظائف أنظمة مستقبلات الهرمونات الأخرى في جميع أنحاء الجسم, مثل المستقبلات المتعلقة بالمخدرات من تعاطي. مباشرة بعد الحصاد ، ضع أنسجة المخ في قوالب الدماغ التي تحاكي الجزء الداخلي من الجمجمة ولف القوالب بورق الألمنيوم لتخزين 20 درجة مئوية تحت الصفر. بعد 30 دقيقة ، انقل المناديل إلى كيس تخزين قابل للغلق وقم بتخزين الكيس عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

قبل التقسيم ، قم بإزالة الدماغ برفق من قالب الدماغ. لتقسيم أنسجة المخ ، انقل العينة المهمة إلى ناظم ناظم بين 10 و 18 درجة مئوية تحت الصفر. عندما يتوازن النسيج مع درجة الحرارة الجديدة ، استخدم وسيطا قائما على الجليكول والراتنج لتضمين جزء صغير من العينة عموديا في حامل الأنسجة لتمكين تقسيم المستوى الإكليلي.

قم بتحميل الأنسجة على الميكروتوم وشد الحامل بإحكام في مكانه ، ثم ابدأ في قطع الدماغ بالسمك المطلوب ، ثم قم بتركيب الأقسام على شرائح المجهر في اتجاه رأسي لتطبيق مساحة سطح أكبر من الأنسجة على الشريحة. اجمع الأقسام في مجموعات متسلسلة من خمسة. عندما يتم جمع جميع الأقسام ، اترك الشرائح تجف في الهواء لمدة تصل إلى ساعة واحدة.

ثم ضع العينات في صندوق منزلق بلاستيكي في كيس تجميد ذاتي الغلق للتخزين عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. لتسمية العينات بالراديو ، قم بإزالة الشريحتين الأولى والثانية من كل مجموعة من خمسة وقم بتركيبها في مقابض الشرائح المتوفرة تجاريا أو المطبوعة ثلاثية الأبعاد. شريحة الاندفاعة الأولى مخصصة لمجموعة العلاج غير المحددة والشريحة الثانية للشرطة لمجموعة العلاج الإجمالية.

اقلب الشرائح في 35 إلى 40 مل من درجة حرارة الغرفة AM5 بالإضافة إلى مثبطاتها الخاصة في برطمانات Coplin المناسبة قبل الحضانة. قد يكون تشغيل مجموعات متعددة من الشرائح أمرا مربكا. لذلك ، من الأهمية بمكان وضع الشرائح في برطمانات ما قبل الحضانة على فترات أربع دقائق للتأكد من عدم وجود تداخل أثناء خطوة التجفيف.

بعد 30 دقيقة ، انقل الشرائح إلى رسائل بريدية منزلقة تحتوي على 10 ملليلتر من AM5 مكملة بالتركيز المناسب ل I125 SI Angiotensin II ومثبطات مجموعة العلاج المعنية لمدة 60 إلى 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يعد تحديد التركيز الدقيق ل 125I SI Ang II أمرا بالغ الأهمية للسماح بمقارنة مستقبلات الأنجيوتنسين II من يوم إلى آخر. في نهاية الحضانة ، أعد الشرائح إلى مقابض الشريحة ، وقم بسد الشرائح ، وقم بتدويرها برفق لمدة ثانية إلى ثانيتين في حاويتين منفصلتين سعة 400 مل من الماء المقطر.

بعد الغسيل الثاني بالماء ، اشطف الشرائح بأربع غسلات متتالية لمدة دقيقة واحدة في 30 إلى 40 مل من AM5. بعد الغسيل الرابع ، قم بتدوير الأقسام برفق لمدة ثانية إلى ثانيتين في أربعة تغييرات من الماء المقطر المثلج. ثم استخدم أربعة مجففات شعر مثبتة بزوايا مختلفة لتجفيف الشرائح بهواء بارد لمدة أربع دقائق.

عندما تجف جميع الأقسام ، انقل الشرائح إلى منشفة ورقية. ثم استخدم شريطا على الوجهين لتركيب الشرائح ، بحيث يكون جانب الأنسجة لأعلى ، على قطعة من الورق المقوى لفيلم الأشعة السينية في الموضع بما في ذلك شريحة قياسية واحدة على الأقل لمعايرة اليود 125 لكل مجموعة. لتصوير كشف الأقسام ، في غرفة مظلمة ، ضع شرائح الورق المقوى داخل شريط الأشعة السينية الخلفي وأطفئ الأضواء.

قم بتشغيل الضوء الآمن وافتح بعناية صندوقا من فيلم الأشعة السينية. ضع فيلما واحدا ، بحيث يكون الجانب اللامع لأعلى مع الحافة الخشنة في الزاوية اليمنى السفلية أعلى الشرائح في الكاسيت. ثم أغلق الكاسيت بعناية مع لف قضبان القفل لإحكام الضوء وتخزين الكاسيت عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.

بعد فترة التعرض المناسبة ، انقل الفيلم إلى محلول المطور لمدة دقيقتين متبوعا ب 30 ثانية في حمام التوقف ، والماء المقطر المزدوج مع حمض الأسيتيك ثم خمس دقائق في محلول المثبت. اغسل الفيلم في صينية من الماء الجاري لمدة 20 دقيقة. انقله إلى سطح الأمواج لمدة 10 ثوان تقريبا الفيلم حتى يجف.

للتحليل النسيجي لأقسام أنسجة المخ ، قم بإذابة الاندفاعة ثلاثة أقسام في رف شرائح. بعد ذلك ، اغسل الأقسام بالماء منزوع الأيونات لمدة دقيقة واحدة متبوعة بحضانة لمدة 10 دقائق في محلول صبغة الثيونين وثلاث غموسات في وعاء ماء واحد منزوع الأيونات. اغمر الشرائح لغسل الماء منزوع الأيونات لمدة 30 ثانية.

ثم اغسل الشرائح في غسلات الإيثانول المتسلسلة كما هو موضح. بعد آخر غسيل للإيثانول بنسبة 100٪ ، اغسل الشرائح في حاويتين من الزيلين لمدة ثلاث وخمس دقائق متتالية. في نهاية غسل الزيلين الثاني ، قم بتغطية الحافة العلوية لشريحة واحدة في كل مرة بقاعدة من الراتنج ، ووسط تركيب مذيبات غير عضوية.

ينزلق غطاء التثبيت 24 × 60 ملم على الشرائح ويترك الشرائح تجف لمدة 48 ساعة. ثم امسح الشرائح والفيلم ضوئيا في الكمبيوتر بتدرج رمادي 2400 نقطة في البوصة. لتحليل الفيلم عن طريق قياس الكثافة ، بعد المسح الضوئي ، حدد بشكل تجريبي مجالات الاهتمام في كل فيلم.

هذه هي الصورة الزائفة الملونة التي تم إنشاؤها بعد فتح الفيلم الممسوح ضوئيا في برنامج تحليل الصور. قم بتضمين الكثافة ومنطقة المسح وإجمالي المساحة المستهدفة في القياسات. اضبط أشرطة منطقة المسح للتأكد من أن كل منطقة ذات أهمية تقع بين معلمات التمييز.

ثم قم بتصدير البيانات إلى جدول بيانات لتحديد الربط المحدد الموجود لكل عينة. يتم تحديد وحدات المعايرة القياسية للقياس الكمي بناء على تاريخ إجراء الفحص. بعد مسح الأفلام ، يتم استخدام قيم المعايرة لإنشاء منحنى يعتمد على التركيزات المتفاوتة من معايير اليود 125 لهذا الفيلم المحدد.

يتم تسجيل المعايرة والقيم القياسية ثلاث نسخ من أجل الدقة. يتم إنشاء الفروق بين الربط غير المحدد والمجموعات الإجمالية بالإضافة إلى ملصقات الأنسجة من خلال تعيين كل مجموعة من البيانات للمجموعات الفرعية المناسبة. يجب تعيين قيمة عتبة أعلى عن طريق ضبط المعلمات من الأحمر إلى الأسود بينما يجب تعيين قيمة العتبة الدنيا بالقرب من الصفر للسماح بقياس أكثر دقة لمنطقة الاهتمام الممسوحة ضوئيا بأكملها.

على سبيل المثال ، هنا تتم مقارنة المناطق المقاسة النهائية للنواة المجاورة للبطين لمنطقة ما تحت المهاد في المجموع مقابل مجموعات الربط غير المحددة بقسم ملطخ بالثيونين للتأكيد التشريحي. الارتباط غير المحدد هو كمية الترابط الإشعاعي المرتبط بمستقبلات غير الأنجيوتنسين في وجود تركيز مشبع من ترابط مستقبلات الأنجيوتنسين الأول غير المشع ، في حين أن الارتباط الكلي هو كمية الترابط الإشعاعي المرتبط في حالة عدم وجود ترابط مستقبلات أنجيوتنسين I غير مشعة. يمكن بعد ذلك طرح قيم الربط غير المحددة من إجمالي قيم الربط للحصول على قيم الربط المحددة لمستقبلات الأنجيوتنسين I.

بمجرد إتقان ، يمكن إكمال خطوة التصوير الشعاعي الذاتي للمستقبلات في حوالي أربع ساعات ، بينما تستغرق خطوة تطوير الفيلم حوالي 30 دقيقة لكل فيلم. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم تتبع الوقت للتأكد من احتضان جميع الشرائح وشطفها وتجفيفها لنفس المدة بالضبط. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء دراسات إضافية لمورفولوجيا الدماغ لتقييم التغيرات في حجم المناطق التي تعرض تعبير مستقبلات الأنجيوتنسين II.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين الذين يدرسون علم الأدوية للمستقبلات لتحديد كيفية تأثر مناطق الدماغ المختلفة بالهرمونات العصبية المختلفة والناقلات العصبية والأدوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء فحص التصوير الشعاعي الذاتي للمستقبلات بنجاح ، والشرائح الملطخة بالأنسجة ، وتقييم التصوير الشعاعي الذاتي لتوطين المستقبلات في مناطق معينة من الدماغ. تذكر أن العمل مع النشاط الإشعاعي يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل التدريع المناسب والاحتواء ومراقبة التعرض والتخلص منه لتجنب التلوث الإشعاعي.