والأحيائي بسيط لتقييم العوامل الأوعية الدموية غشائي النمو

يتمثل الهدف العام من هذا المقايسة الحيوية البسيطة القائمة على الخلايا في الكشف عن نشاط أعضاء عائلة عامل نمو البطانة الوعائية من الليجاندات وتقديرها وراقبتها. ويمكن لهذه الطريقة الإجابة على أسئلة رئيسية في بيولوجيا الأوعية الدموية، وعلم الفيروسات، والسرطان، وطب العيون، حيث تلعب ليجاندات عائلة VEG-FR دوراً محورياً في العمليات الأساسية لهذه الأمراض. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه المقايسة في أنها تسمح بتقييم ليجاندات عائلة VEG-FM من حيث قدرتها على الارتباط بمستقبلاتها المختلفة وربطها تشابكياً دون الحاجة إلى خلايا ظهارية متخصصة.

قم بزراعة الخط الخلوي WEHI-3D المفرز لـ IL3 عن طريق نقل 5×10⁶ خلية في طور النمو اللوغاريتمي إلى ما بين أربعة إلى عشرة دوارق T175 تحتوي كل منها على 50 ml من وسط زراعة جديد. يتم التحضين لمدة سبعة أيام أو حتى تتجاوز الخلايا طور نموها اللوغاريتمي بنحو 24 إلى 48 ساعة. بعد ذلك، قم بتفريغ السائل والخلايا من الدوارق.

ثم يتم الطرد المركزي عند 1,000 Gs لمدة 15 دقيقة لإزالة الخلايا والحطام الخلوي. بعد ذلك، يتم سحب 90% من الطبقة العلوية للسائل الطافي وترشيحها عبر وحدة ترشيح بمسامية 0.22 micron. تُقسم الأوساط الشرطية إلى حصص سعة كل منها واحد milliliter لتحضير المقايسة.

حصص بحجم 50 milliliter لتحضير الوسط الزرعي لتمرير خطوط خلوية معتمدة على عامل معين، وأحجام 200 milliliter للتخزين طويل الأمد عند 20 degree Celsius. تُخزن الأحجام الأصغر عند 20 Celsius. تُزرع خلايا BAF3 الضابطة في أوساط زرعية تحتوي على 10% من الوسط المشروط WEHI-3D.

وخلايا VegFR2-EPoR-BAF3 في الوسط نفسه بالإضافة إلى 1 mg/mL من G418. يتم تمرير الخلايا بتخفيفات تتراوح من 1 إلى 15 من الخلايا التي تنمو في طور النمو اللوغاريتمي. يتم حصاد خلايا BAF3 الضابطة أو خلايا VegFR2VPoR-BAF3 من المزارع التي وصلت إلى منتصف طور النمو اللوغاريتمي.

قم بسحب الخلايا بلطف باستخدام الماصة من قاع الدورق، ثم قم بالطرد المركزي عند 750 Gs لمدة خمس دقائق لاستعادة كتلة الخلايا. أعد تعليق الكتلة في 10 milliliters من محلول الفوسفات المنظم الملحى (phosphate buffered saline) المتوافق مع أسموزية الفأر، وقم بالطرد المركزي مرة أخرى عند 750 Gs لمدة خمس دقائق. كرر عملية الغسل مرتين إضافيتين لإزالة الوسط الذي يحتوي على IL3.

اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام وسط غذائي خالٍ من الوسط المكيف بـ DEHI-3D. من المهم غسل الوسط الزرعي الذي يحتوي على IL3 لضمان عدم بقاء أي عوامل نمو إضافية، والتي قد تؤدي إلى ظهور نتيجة إيجابية كاذبة أو نشاط خلفي مرتفع. بعد الطرد المركزي والتخلص من الرائق، أعد تعليق الخلايا في نفس الوسط الخالي من IL3 بتركيز 7.4 × 10⁴ خلية لكل milliliter.

أخيراً، اخلط أحجاماً متساوية من صبغة تريبان بلو (trypan blue) في محلول PBS مع مجموعة الخلايا، ثم حمّل المزيج في مقياس كرات الدم (hemacytometer). قم بعدّ 100 خلية على الأقل. وتعتبر الخلايا التي امتصت الصبغة خلايا ميتة أو في طور الموت.

من الضروري أن تتمتع الخلايا المستخدمة في المقايسة بحيوية عالية لضمان قدرتها على الاستجابة لظروف المقايسة. استخدم ماصة آلية P20 معايرة جيداً ورؤوس ماصة معقمة بالأتوتكلاف لإضافة 1,000 خلية في 13.5 microliters من وسط غذائي يفتقر إلى IL إلى آبار طبق يحتوي على 72 بئراً. احرص على خلط معلق الخلايا أثناء عملية التوزيع لضمان عدم تأثير ترسب الخلايا بفعل الجاذبية على تركيز الخلايا.

استخدم ماصة P2 معايرة جيداً لإضافة 1.5 µL من الوسط الخالي من IL3 في ثلاث مكررات إلى آبار التحكم. اخلط المزيج بدقة. وبنفس الطريقة، أضف الوسط المكيف من خلايا 10%WEHI-3D وعنصر التحكم VegFA بتركيز 100 ng/mL الخالي من IL3 إلى الآبار المطلوبة.

أضف أخيراً 1.5 µL من عينات الاختبار في ثلاث مكررات. املأ أي آبار غير مستخدمة في لوحة الآبار الدقيقة بماء معقم، أو PBS أو وسط زراعي. ضع مناديل ورقية مبللة بالماء في حاوية نفاذة للغاز لإنشاء غرفة ترطيب تسمح بتبادل الغازات.

قم بتحضين أطباق المقايسة في الغرف ضمن جو رطب يحتوي على 10% من ثاني أكسيد الكربون لمدة 16 ساعة. وبعد مرور 16 ساعة من التحضين، قم بتحليل الأطباق باستخدام مجهر طوري مقلوب قياسي بتكبير يتراوح من 40 إلى 100x. وفي هذه المرحلة، يمكن التمييز بين العينات الإيجابية والسلبية.

ستظهر الآبار التي تفتقر إلى عوامل النمو أو التي تحتوي على الوسط الغذائي وحده انخفاضاً في أعداد الخلايا المستديرة، بالإضافة إلى وجود خلايا ميتة أو في طور الموت وبقايا خلوية. بينما تكون الخلايا التي تم تحضينها في وسط يحتوي على IL3 أو ربيطة لـ VegFR2 كبيرة وشفافة، مع عدم وجود أو وجود حد أدنى من الأدلة على التحبب في سيتوبلازم الخلية أو وجود بقايا خلوية في المزرعة. أضف 10,000 خلية مغسولة في 135 µL من وسط خالٍ من IL3 إلى آبار طبق قياسي مكون من 96 بئراً.

استخدم ماصة P20 مُعايرة لإضافة 15 µL من عينات الاختبار وعينات الضبط إلى الآبار. قم بتحضين المزيج المكون من الخلايا وعوامل النمو و/أو عوامل التثبيط كما سبق لمدة 48 ساعة. عند انتهاء فترة التحضين، قم بتقييم عدد الخلايا الحية في الآبار باستخدام الطرق الموضحة في الجزء المكتوب من البروتوكول.

تظهر هنا نتائج مقايسة تم فيها استخدام المقايسة الحيوية VEGF-R2 EPoR BAF3 لتقدير نشاط ثلاثة ليجاندات بشرية معاد تركيبها ذات خصوصية لـ VEGF-R2، وهي: VEGF-A165 وVEGF-C وVEGF-D. تم تقدير النشاط في وجود bevacizumab، وهو جسم مضاد أحادي النسيلة مثبط لـ VEGF-A165، أو في وجود trastuzumab، وهو جسم مضاد غير معادِل.

تم تطبيع البيانات مقارنة بالاستجابة لـ VEGF-A165 وحده. وكما هو متوقع، قام bevacizumab بتثبيط تأثير VEGF-A165 في المقايسة، ولكن لم يكن له أي تأثير على نشاط VEGF-C و VEGF-D. وكانت الخلايا المعرضة لـ IL3 ذات حيوية عالية.

في حين تُظهر الخلايا التي لم تتعرض لأي عامل نمو إضافي ضعفاً في الحيوية. وعند محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم مراعاة وجود مجموعة من العوامل الضابطة في الأوساط المكيفة التي يجب تحضيرها قبل إجراء المقايسة. وقد مهدت هذه التقنية الطريق لعودة الاهتمام في مجالات بيولوجيا الأوعية الدموية، وعلم الفيروسات، والسرطان، وطب العيون لاستكشاف دور VEG-FM في ligins.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تحضير خلايا المقايسة الحيوية، وتشغيل المقايسة الحيوية، وإجراء التحليلات الكمية أو شبه الكمية لنشاط VEG-FM ligin.