والأحيائي بسيط لتقييم العوامل الأوعية الدموية غشائي النمو

الهدف العام من هذا الاختبار الحيوي البسيط القائم على الخلايا هو اكتشاف وقياس ومراقبة نشاط أعضاء عائلة عامل نمو بطانة الأوعية الدموية من الليجينات. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا الأوعية الدموية وعلم الفيروسات والسرطان وطب العيون ، حيث تشع روابط عائلة VEG-FR العمليات الرئيسية في هذه الأمراض. الميزة الرئيسية لهذا الاختبار هي أنه يسمح بتقييم ليجينات عائلة VEG-FM من حيث قدرتها على ربط مستقبلاتها المختلفة وربطها دون الحاجة إلى خلايا ظهارية متخصصة.

استزراع خط الخلية المفرز IL3 WEHI-3D عن طريق سحب خمس مرات في عشرة إلى الخلايا السادسة في وجه النمو اللوغاريتمي إلى أربعة إلى عشرة قوارير T175 تحتوي على 50 ملم من وسط الاستزراع الطازج. احتضان لمدة سبعة أيام أو حتى تمر الخلايا بمرحلة النمو اللوغاريتمية بحوالي 24 إلى 48 ساعة. صب السائل والخلايا من القوارير.

وتدور بسرعة 1000 جم لمدة 15 دقيقة لإزالة الخلايا والحطام الخلوي. ثم قم بإزالة الجزء العلوي 90٪ من supernaytent وقم بتصفيته من خلال وحدة تصفية 0.22 ميكرون. اقتبس الوسط المكيف في مليلتر واحد لتحضير الفحص.

50 مليلتر من الحصص لجعل وسط الثقافة لمرور خطوط خلوية تعتمد على العامل و 200 مليلتر للتخزين طويل الأجل عند 20 درجة مئوية. قم بتخزين الأحجام الأصغر عند 20 درجة مئوية. تتحكم الثقافة في خلايا BAF3 في وسط الاستزراع الذي يحتوي على 10٪ WEHI-3D وسط مكيف.

وخلايا VegFR2-EPoR-BAF3 في نفس الوسائط بالإضافة إلى ملليغرام واحد لكل مليلتر G418. خلايا المرور في واحد إلى 15 تخفيفا من الخلايا التي تنمو في مرحلة السجل. التحكم في الحصاد BAF3 أو خلايا VegFR2VPoR-BAF3 لثقافات مرحلة السجل المتوسطة.

عن طريق سحب العينة برفق لإزالة الخلايا من قاع جهاز الطرد المركزي للقارورة عند 750 Gs لمدة خمس دقائق لاستعادة حبيبات الخلية. أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من فوسفات توتر الفوس المخزنة والمحلول الملحي وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 750 Gs لمدة خمس دقائق. كرر الغسيل مرتين أخريين لإزالة الوسط الذي يحتوي على IL3.

اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام الوسائط بدون وسيط مكيف DEHI-3D. من المهم غسل وسط الاستزراع الذي يحتوي على IL3 لضمان عدم وجود عوامل نمو إضافية ، مما قد يؤدي إلى نتيجة إيجابية خاطئة أو نشاط خلفية مرتفع. بعد الطرد المركزي والتخلص من supernayten ، أعد تعليق الخلايا في نفس الوسط الخالي من IL3 بتركيز 7.4 في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل مليلتر.

أخيرا ، امزج كميات متساوية من التريبان الأزرق في PBS مع مجموعة الخلايا وقم بتحميلها في مقياس الدم. عد ما لا يقل عن 100 خلية. تعتبر الخلايا التي تمتص الصبغة ميتة أو تحتضر.

من الأهمية بمكان أن تتمتع الخلايا المستخدمة في الفحص بقدرة عالية على البقاء لضمان قدرتها على الاستجابة لظروف الفحص الخاصة بها. استخدم ماصة P20 الآلية معايرة جيدا والأطراف المعقمة لإضافة 1,000 خلية في 13.5 ميكرولتر من وسط IL الناقص إلى آبار صفيحة 72 بئر. احرص على خلط تعليق الخلية أثناء الاقتباس للتأكد من أن استقرار الخلية عن طريق الجاذبية لا يؤدي إلى تحيز تركيز الخلية.

استخدم ماصة P2 معايرة جيدا لإضافة 1.5 ميكرولتر من الوسائط الخالية من IL3 في ثلاث نسخ إلى آبار التحكم. معقدة للخلط. بنفس الطريقة ، أضف الوسط المكيف بنسبة 10٪ WEHI-3D و 100 نانوجرام لكل مليلتر VegFA no IL3 التحكم إلى الآبار المرغوبة.

أخيرا أضف 1.5 ميكرولتر من عينات الاختبار ثلاث نسخ. املأ أي آبار غير مستخدمة من لوحة الميكروويل بالماء المعقم أو PBS أو المتوسط. ضع المناديل الورقية المبللة بالماء في وعاء منفذ للغاز لإنشاء غرفة مرطبة تسمح بتبادل الغازات.

احتضان ألواح الفحص في الغرف في جو مرطب بنسبة 10٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 16 ساعة. بعد 16 ساعة من الحضانة ، قم بتحليل الألواح باستخدام مجهر الطور المقلوب القياسي بتكبير 40 إلى 100 ضعف. في هذا الوقت ، من الممكن التمييز بين العينات الإيجابية والسلبية.

الآبار التي لا تحتوي على دعم من عوامل النمو أو مع الوسط وحده سيكون لها عدد أقل من الخلايا المستديرة بالإضافة إلى الخلايا الميتة أو المحتضرة والحطام الخلوي. في حين أن الخلايا المحتضنة بوسط يحتوي على IL3 أو ligin ل VegFR2 كبيرة وشفافة ولا يوجد دليل ضئيل على الحبيبات في سيتوبلازم الخلية أو بقايا الخلية في المزرعة. أضف 10 ، 000 خلية مغسولة في 135 ميكرولتر من وسط IL3 الناقص إلى آبار صفيحة 96 بئر قياسية.

استخدم ماصة P20 معايرة لإضافة 15 ميكرولترا من عينات الاختبار وأدوات التحكم إلى الآبار. احتضان خليط من عوامل نمو الخلايا و / أو العوامل المثبطة كما كان من قبل لمدة 48 ساعة. عند الانتهاء من فترة الحضانة ، قم بتقييم عدد الخلايا القابلة للحياة في الآبار باستخدام الطرق الموضحة في الجزء المكتوب من البروتوكول.

فيما يلي نتائج ممثلة لمقايسة يتم فيها استخدام المقايسة الحيوية VEGF-R2 EPoR BAF3 لتحديد نشاط الليجين البشري الثلاثة الراقد مع خصوصية VEGF-R2. VEGF-A165 و VEGF-C و VEGF-D. تم قياس النشاط كميا في وجود بيفاسيزوماب ، وهو جسم مضاد أحادي النسيلة مثبط ل VEGF-A165 أو في وجود تراستوزوماب ، وهو جسم مضاد غير معادل.

تم تطبيع البيانات مقابل الاستجابة ل VEGF-A165 وحدها. كما هو متوقع ، منع بيفاسيزوماب تأثير VEGF-A165 في الفحص ولكن لم يكن له أي تأثير على نشاط VEGF-C و VEGF-D. كانت الخلايا المعرضة ل IL3 قابلة للحياة للغاية.

في حين أن أولئك الذين لا يتعرضون لأي عامل نمو إضافي يظهرون ضعف الجدوى. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تضع في اعتبارك أنها مجموعة من عوامل التحكم في الوسائط المشروطة التي يجب إنشاؤها قبل الفحص. مهدت هذه التقنية الطريق لعودة الظهور في بيولوجيا الأوعية الدموية وعلم الفيروسات والسرطان وعلم العيون لاستكشاف دور VEG-FM في الليجينات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير خلايا المقايسة الحيوية ، لتشغيل المقايسة الحيوية وإجراء التحليلات الكمية أو شبه الكمية لنشاط ligin VEG-FM.