تنظيم جينية من القلب تمايز الخلايا الجذعية الجنينية والأنسجة

إن الهدف العام من تطبيق منهجيات الترسيب المناعي للكروماتين هذه على الخلايا الجذعية الجنينية المتمايزة أو الأنسجة الجنينية القلبية هو الكشف عن التنظيم فوق الجيني لتطور القلب. ونظراً لأن الضبط الدقيق لنسخ الجينات أثناء تطور الحبل السري الجنيني يتم تنظيمه بواسطة مكونات فوق جينية، فإن الترسيب المناعي للكروماتين يعد منهجاً مناسباً لفهم هذه العملية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في قدرتنا على استهداف موقع محدد وبحث العلامات فوق الجينية الموجودة على تلك القطعة المحددة من DNA. ويمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية متعمقة حول التنظيم فوق الجيني لتطور القلب، كما يمكن تطبيقها على أعضاء أخرى أو أي أنواع من الخلايا.

هذه إيمان، وهي طالبة دكتوراه في المختبر وستقوم بإجراء التجربة اليوم. يعتمد هذا الإجراء على استخدام الخلايا الجذعية الجنينية (ES cells).

أجسام جنينية مستمدة من خلايا ES وأنسجة قلب جنينية مستأصلة من أجنة فئران في اليوم التاسع والنصف من الحمل (E9.5). قم بتثبيت الخلايا والأنسجة. استخدم 1% formaldehyde في PBS للخلايا ومحلول PB2 permeabilization buffer للأنسجة الجنينية.

ضع الأنابيب على هزاز مداري بسرعة 60 RPM في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق بالضبط. أوقف تفاعل الربط التشابكي بإضافة الجلايسين ليصل إلى تركيز نهائي قدره 125 millimolar، ثم حضّن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة على الهزاز المداري بسرعة 60 RPM. لبدء هذا الإجراء، أعد تعليق الراسب في 10 milliliters من PBS.

ثم تُوضع الأنسجة الجنينية في 1 mL من PB2. تُطرد مركزياً بسرعة 1000 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C. يُتخلص من السائل الطافي ويُضاف المنظم المقابل لإجراء غسلة ثانية.

أضف مثبطات البروتياز إلى المحلولين المنظمين PB1 وPB2 على الثلج. أضف واحد milliliter من المحلول المنظم PB1 المضاف إليه مثبطات البروتياز إلى الكتلة الخلوية، ثم استخدم الماصة للسحب والدفع لإعادة تعليق الخلايا. وبنفس الطريقة، أعد تعليق الأنسجة الجنينية في واحد milliliter من المحلول المنظم PB2 المضاف إليه مثبطات البروتياز.

بعد ذلك، استخدم سرنجة سعة 1 مل مع إبرة قياس 21 G لعمل تجانس للخلايا أو الأنسجة. انقل معلق الخلايا إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 مل. حضن الخلايا والأنسجة المتجانسة عند درجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق.

يُجرى الطرد المركزي بسرعة 3000 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C. يتم التخلص من السائل الطافي وإعادة تعليق كل راسب في 300 µL من محلول التخفيف الخاص بالسونيكشن (sonication buffer) المناسب، والمُدعم بمثبطات البروتياز. يتم نقل معلق الخلايا إلى أنبوب معتمد كونه خالياً من RNase وDNase والبيروجينات لمنع أي تحلل للحمض النووي DNA، ثم يُحضن على الثلج لمدة تتراوح من 15 إلى 30 دقيقة.

لتجزئة الكروماتين، قم بعملية السونيكة للعينات عند درجة حرارة 4 °C باستخدام برنامج السونيكة المناسب لكل مادة. اضبط مدة السونيكة بناءً على ما إذا كان سيتم استخدام DNA في تفاعل PCR أو التسلسل. بعد ذلك، قم بطرد تحللات الخلايا التي خضعت للسونيكة مركزياً لمدة 10 دقائق.

انقل السائل الطافي، وهو الكروماتين الذائب، من كل عينة إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 milliliter وتخلص من الراسب. خذ مقدار 1.5 microliter من كل عينة وقم بتخفيفه بنسبة 1:10 بالماء. قم بقياس الكثافة الضوئية لجميع العينات باستخدام جهاز nano spectrophotometer لتحديد تركيز البروتين.

قبل البدء في عملية الترسيب المناعي للكروماتين، قم بتحضير الحبيبات المقترنة بالبروتين A عن طريق غسلها كما هو موضح في نص البروتوكول. في أنبوب نظيف سعة 1.5 milliliter، اخلط الأجسام المضادة الموجهة ضد الهستونات المعدلة أو عوامل النسخ، مع 20 µL من الحبيبات المغسولة والمقترنة بالبروتين A، ومليلتر واحد من buffer C المدعم بمثبطات البروتياز. قم بتحضين العينات على جهاز تدوير بسرعة 40 RPM لمدة ساعتين على الأقل عند درجة حرارة 4 °C.

اغسل معقدات الخرزات والأجسام المضادة ثلاث مرات باستخدام 1 mL من المنظم C كما هو موضح في نص البروتوكول. جهّز أنبوبين، يحتوي أحدهما على 150 µg من الكروماتين ومعقدات الخرزات والأجسام المضادة، ويحتوي الآخر على 150 µg من الكروماتين و20 µL من الخرزات المغسولة. أضف 1 mL من المنظم C المضاف إليه مثبطات البروتياز إلى كل أنبوب، واحضن العينات على عجلة دوارة بسرعة 40 RPM طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C.

عند اكتمال عملية الترسيب المناعي overnight، ضع العينات في الحامل المغناطيسي واسترجع الطافي الذي يحتوي على الكروماتين والأجسام المضادة غير المرتبطة. قم بشطف البروتين المرتبط بالجسم المضاد عن طريق إضافة 150 µL من buffer D1 إلى المواد المغسولة. قم بحضن العينات لمدة 20 دقيقة عند 50 °C في كتلة تسخين.

بعد مرور 20 دقيقة، أخرج العينات من وحدة التسخين وضعها في الحامل المغناطيسي. استرجع المادة الطافية في أنبوب نظيف سعة 1.5 milliliter وتخلص من الخرزات. لعكس الربط التشابكي، أضف كلوريد الصوديوم بتركيز خمسة مولار إلى المادة الطافية للحصول على تركيز نهائي قدره 200 millimolar.

قم بتحضير عينة دخل من الكروماتين في أنبوب نظيف سعة 1.5 milliliter. استخدم نفس كمية الكروماتين المستخدمة في عينة الترسيب المناعي في حجم نهائي قدره 150 microliters من ماء خالٍ من RNase وDNase وكلوريد الصوديوم بتركيز خمس molar ليصل إلى تركيز نهائي قدره 200 millimolar. قم بحضن العينات طوال الليل عند درجة حرارة 65 degree Celsius.

في اليوم التالي، قم بإزالة العينات من وحدة التسخين. أضف EDTA بتركيز نهائي قدره 12.5 millimolar و Proteinase K بتركيز نهائي قدره 250 micrograms per milliliter وقم بالهضم عند 55 °C لمدة ساعتين. ابدأ هذا الإجراء بتجهيز الخرزات.

أولاً، تُترك الخرزات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل. بعد ذلك، تُخلط الخرزات باستخدام جهاز المجيج (vortex) جيداً، ثم يتم سحب 1 مل من الخرزات بسرعة ونقلها إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 مل. يُوضع أنبوب الخرزات على المغناطيس لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى يصفو المحلول، ثم يتم التخلص من السائل الطافي.

قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس. أضف 1 mL من EDTA بتركيز 0.5 M واخلط المزيج عن طريق الرج السريع (vortexing). اغسل الخرزات مرتين بهذه الطريقة، ثم تخلص من السائل الطافي بعد الغسلة النهائية.

أخرج الأنبوب من المغناطيس. أضف 1 mL من المنظم E وأعد تعليق الخرزات ببطء. انقل الخليط بالكامل إلى 50 mL من المنظم E. ضعه على جهاز هزاز واتركه يمتزج ببطء في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك، اختبر حبيبات ربط DNA باستخدام سلم DNA بحجم 1 KB وثلاث نسب مختلفة من حجم الحبيبات إلى حجم DNA. وقد تبيّن أن نسبة 2.5/1 هي الأفضل لربط DNA. ولتطبيق هذه الحبيبات في تنقية DNA، أضف 425 µL أو 2.5 ضعف حجم الحبيبات إلى كل عينة DNA، ثم أعد تعليقها ببطء عن طريق السحب والدفع بالماصة حوالي 10 مرات.

يُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. يوضع على المغناطيس لمدة خمس دقائق، ثم يتم سحب السائل الطافي والتخلص منه.

اغسل مرتين باستخدام إيثانول 80% مُحضّر حديثاً عن طريق إضافة 600 microliters إلى كل أنبوب. انتظر لمدة دقيقة واحدة، ثم قم بشفط والتخلص من الطافي. قم بتدوير الأنابيب بسرعة في جهاز الطرد المركزي.

ضع الأنابيب على المغناطيس. تخلص من قطرات الإيثانول الأخيرة واتركها تجف لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ارفع العينة عن المغناطيس واستخلص الـ DNA بإضافة 20 µL من الماء الخالي من DNase و RNase. قم بالرج باستخدام جهاز الـ Vortex.

كشف الفصل الكهربائي لهلام الأجاروز عن أحجام قطع DNA التي تم الحصول عليها بعد عكس التشابك لـ DNA الكلي المُجزأ بالسونيكات والمستخلص من خلايا mouse ES، والأجسام الجنينية، وأنسجة القلب الجنينية. تم تصميم تجربة الترسيب المناعي للكروماتين لدراسة التنظيم فوق الجيني لجينات الانتقال الظهاري-الميزنشيمي في الخلايا البرية أو الخلايا الطافرة جينيًا، عندما تتمايز خلايا ES نحو مصير خلوي ميزودرمي. وتمت مراقبة ارتباط الهستونات المعدلة عن طريق PCR للمحفزات أو المعززات لجينات E-Cadherin وTwist.

أُجري ترسيب مناعي متسلسل للكروماتين على كروماتين مستخلص من أربعة خطوط خلوية من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (human ES cell lines)، وذلك باستخدام أجسام مضادة لعلامة تنشيط الكروماتين، تلتها أجسام مضادة لعلامة كبح. وتتغير هذه العلامات عندما تتعرض الخلايا لمحفزات شكلية (morphogens)، إلا أنها تتباين باختلاف خطوط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، ويرجح أن يكون ذلك بسبب البلاستوسيتات الأصلية التي اشتُقت منها هذه الخطوط.

يمكن تطبيق الترسيب المناعي للكروماتين أيضاً على الكروماتين المستخلص من مناطق قلبية جنينية محددة. يوضح هذا الشكل المناطق الجينومية للجينات القلبية Nkx2.5 و TBx5 المثرية في الهيستون المعدل، ومنطقة جينومية واحدة من جين Shox2 الخاص بناظم الخطى غير المثرية وغير المعبر عنها في البطين. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون ثلاث ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر قياس كفاءة السونكة (sonication efficiency) قبل البدء في بروتوكول الترسيب المناعي (IP). وعقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل Eth-ek-se-ek للإجابة على تساؤلات إضافية، مثل استقصاء الحالة السابقة للكروماتين سواء كانت مفتوحة أو مغلقة، أو مراقبة تباعد النيوكليوسومات. وقد مهدت هذه التقنية بعد تطويرها الطريق للباحثين في مجال علم فوق الجينات (epigenetics) لاستكشاف أي تنظيم فوق جيني لقرارات مصير الخلية في أي نوع من الخلايا أو الأعضاء الجنينية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية إجراء فحوصات الترسيب المناعي للكروماتين.