عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة
مارس 12, 2016
يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل الخلايا المفردة من أجنة الزرد ، وإثراء الخلايا ذات الأهمية ، والتقاط خلايا الزرد في أنظمة تعدد الإرسال أحادية الخلية القائمة على الموائع الدقيقة ، وتقييم التعبير الجيني من الخلايا المفردة.
الهدف العام من هذه التجربة هو عزل الخلايا المفردة من أجنة أسماك الزرد في المرحلة المبكرة لالتقاط في نظام تعدد الإرسال أحادي الخلية قائم على الموائع الدقيقة لتقييم التعبير الجيني للخلايا الفردية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء التنموي ، مثل التغييرات النسخية التي تمر بها الخلايا أثناء المواصفات والتمايز. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها نهج غير متحيز للكشف عن عدم التجانس المقنع في التقنيات التقليدية القائمة على السكان.
بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه التقنية لأن توليد المستحضرات القابلة للحياة للخلايا المفردة يمثل تحديا تقنيا ولكنه ضروري للتحليل النهائي. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال معالجة عينات الجنين بأكملها في خلايا مفردة محللة على شريحة ميكروفلويديك مدمجة في غضون ست ساعات إذا تم تنفيذ الخطوات بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر التأكد من التقاط خلايا مفردة فقط على جهاز الموائع الدقيقة.
بعد تربية أسماك الزرد البرية البالغة والمعدلة وراثيا ، اجمع الأجنة على فترات 15 دقيقة وفقا لإجراءات التشغيل القياسية المعتمدة من المنشأة والمؤسسة. بعد ساعتين على الأقل ، انقل 100 إلى 300 جنين مخصب من نقطة زمنية واحدة إلى طبق بتري جديد يحتوي على ماء البيض العذب. واستخدم ملقطا دقيقا لإزالة المشيمة يدويا من كل جنين.
بعد ذلك ، استخدم ماصة زجاجية عريضة التجويف لنقل الأجنة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مليلتر في الحد الأدنى من ماء البيض. عندما يتم نقل جميع الأجنة ، استبدل الماء ب 1 مليلتر من ماء البيض المثلج واغمر الأنبوب في الثلج لمدة 20 دقيقة. بعد القتل الرحيم ، استخدم ماصة زجاجية عريضة التجويف لإزالة المادة الطافية.
وماصة P-1000 لإضافة ماء البيض العذب إلى الأجنة مرتين. بعد الغسيل الثاني ، استبدل ماء البيض ب 1 مليلتر من محلول إزالة الصفار واستخدم ماصة P-1000 لترثيل الأجنة من ثماني إلى 12 مرة حتى يذوب الصفار وتظهر أجسام الأجنة فقط. جمع الأنسجة عن طريق الطرد المركزي.
بعد ذلك ، استخدم الماصة لإزالة المادة الطافية برفق دون إزعاج حبيبات الأنسجة ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مليلتر من ماء البيض العذب. بعد غسل الأجنة مرتين أخريين ، أعد تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من كاشف تفكك الخلية بدرجة حرارة الغرفة -1. ثم ضع الأنبوب على جانبه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
مع التخلي اللطيف كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق لمنع التكتل. في نهاية الحضانة ، قم بتدوير الخلايا مرة أخرى وأعد تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من كاشف تفكك الخلية -2. احتضان الخلايا أفقيا في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى 15 دقيقة أخرى مع تجربة لطيفة كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق.
كل خمس دقائق ، قم بتخفيف 2 ميكرولتر من المادة الطافية في 18 ميكرولترا من محلول FACS ، وقم بتوزيع الخلايا على شكل قطرة على طبق زراعة الخلايا. ضع غطاء فوق العينة واستخدم مجهر زراعة الأنسجة لتقييم تقدم الهضم بتكبير 10 و 20 ضعفا. عندما يبدو المستحضر مزيجا من الخلايا المفردة بشكل أساسي مع بعض مجموعات الخلايا الصغيرة والكبيرة وعدد قليل من أجسام الأجنة السليمة في الغالب ، قم بتدوير الخلايا وأعد تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من عازلة FACS الباردة.
بعد ذلك ، بلل مصفاة خلية 40 ميكرون باستخدام مخزن FACS. وقم بتصفية الخلايا من خلال المصفاة في طبق ثقافة خلية 35 ملم. بعد تدوير الخلايا مرة أخرى ، أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، واحسب عدد الخلايا القابلة للحياة عن طريق استبعاد Trypan blue.
بعد ذلك ، قم بتخفيف العينة إلى 5 أضعاف 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر. واحتفظ ب 10 إلى 20٪ من الخلايا للتحكم غير الملوث. تلطخ باقي الخلايا بصبغة تمييز الحية / الميتة الفلورية.
ثم بلل أنبوب FACS مغطى بمصفاة خلية 35 ميكرون ب 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت FACS ، وأضف الخلايا إلى المصفاة ، وجمعها عن طريق الجاذبية. باستخدام استراتيجية البوابات الموضحة ، قم بفرز الخلايا الحية المفردة التي تعبر عن علامة الفلورسنت. التحقق من البوابة باستخدام الخلايا ذات الواجهة المزدوجة.
قم بفرز 2 ، 000 إلى 4 ، 000 خلية من السكان محل الاهتمام في 5 ميكرولتر من عازلة FACS الباردة في أنبوب طرد مركزي دقيق على الجليد. ثم انقل 1 ميكرولتر من الخلايا التي تم فرزها إلى أنبوب FACS جديد مع 100 ميكرولتر من مخزن فرز FACS وتخفيف من 1 إلى 1 ، 000 من البقعة الحية / الميتة. وقم بتشغيل عينة الخلية باستخدام بوابات الفرز لتقييم جدوى الفرز اللاحق.
بعد ذلك ، قم بتحميل 1 ميكرولتر من الخلايا المخففة في 9 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS على مقياس كثافة الدم لتحديد تركيز الخلية ومتوسط قطرها. حدد الآن دائرة موائع دقيقة متكاملة ، أو شريحة IFC ، بالحجم المناسب لمتوسط قطر الخلية للعينة ، وقم بتجهيز السوائل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتحميل الخلايا على اللوحة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وقم بتحميل اللوحة في آلة سائلة متوافقة.
ثم قم بتشغيل برنامج نصي مناسب لتحميل الخلية لشريحة IFC لدفع الخلايا إلى ممرات الالتقاط. للتأكد من أن الخلايا موجودة في مواقع الالتقاط ، قم بتركيب اللوحة على مجهر مزود بمحول لوحة واحصل على صور ساحقة ومضان لكل موقع التقاط بتكبير 10x. يمكن بعد ذلك معالجة الخلايا لتقييم المصب للتعبير الجيني المستهدف عن طريق QRT-PCR.
في مرحلة 18 جسدية ، يمكن استخدام الفحص المجهري الفلوري للتحقق من تعبير ZsYellow للأجنة. بعد الفرز ، يتم الحصول على خلايا ذات مجموعة من الأقطار. يمكن استخدام لوحة IFC لالتقاط الخلايا ذات القطر المثير.
على سبيل المثال ، في هذه التجربة ، يبلغ قطر الخلايا من خمسة إلى 10 ميكرومترات. كما هو متوقع ، عبرت الخلايا التي تم فرزها والتقاطها من أجنة ما بعد الإخصاب لمدة 18 ساعة عن علامة الفلورسنت ZsYellow. هنا ، تم استخدام QRT-PCR لتقييم التعبير الجيني النسبي لجينات معينة ذات أهمية في 40 خلية مفردة من مواقع التقاط الخلايا على لوحة IFC.
نظرا لأن نطاق قيم عتبة الدورة لجين التدبير المنزلي كان واسعا جدا لمقارنة التعبير الجيني بين العينات وتجاوزت العديد من قيم عتبة الدورة 30 ، فقد تم تصور القيم كخريطة حرارية. بالمقارنة عبر العينات ، لوحظ عدم تجانس كبير في التعبير الجيني في هذه التجربة. مع الخلايا المصنفة على أنها أنواع من 1 إلى 5 بناء على نمط التعبير الجيني الخاص بها.
بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال معالجة عينات الجنين بأكملها في خلايا مفردة على شريحة ميكروفيليديك متكاملة في غضون ست ساعات إذا تم تنفيذ الخطوات بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه يتم التقاط خلايا مفردة فقط على شريحة الموائع الدقيقة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسلسل الخلية المفردة عالي الإنتاجية لتوصيف نسخ الخلايا المفردة بشكل كامل.
بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء التنموي لاستكشاف عدم التجانس الخلوي في الأجنة المبكرة النمو. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا المفردة من أجنة الزرد ، والتقاط خلايا مفردة في نظام تعدد الإرسال أحادي الخلية ذو قاعدة الموائع الدقيقة وتقييم التعبير الجيني للخلايا الفردية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل الخلايا المفردة من أجنة أسماك الزيبرا، وإثراء الخلايا ذات الاهتمام، وتقييم التعبير الجيني من الخلايا المفردة باستخدام نظام قائم على الميكروفلويديك. تكشف هذه التقنية عن التنوع الخلوي الذي غالبًا ما يكون مخبوءًا في الطرق التقليدية القائمة على التجمعات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء التنموي
- علم الأحياء الخلوي
- تحليل التعبير الجيني
الخلفية
- عزل الخلايا المفردة من الأجنة أمر معقد تقنيًا.
- تسمح هذه الطريقة بتقييم غير متحيز للتغيرات النسخية.
- فهم تحديد الخلايا وتمايزها أمر بالغ الأهمية في علم الأحياء التنموي.
- تعزز الأنظمة الميكروفلويديك كفاءة تحليل الخلية المفردة.
غرض الدراسة
- لعزل الخلايا المفردة من أجنة أسماك الزيبرا في المراحل المبكرة.
- لتقاط هذه الخلايا لتحليل التعبير الجيني.
- لدراسة التغيرات النسخية أثناء تمايز الخلايا.
الطرق المستخدمة
- عزل الخلايا المفردة من أجنة أسماك الزيبرا.
- إثراء أنواع خلوية معينة.
- استخدام الأنظمة القائمة على الميكروفلويديك لالتقاط الخلايا.
- تقييم التعبير الجيني من الخلايا الفردية.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح للخلايا المفردة القابلة للحياة.
- تحديد التنوع النسخيّ بين الخلايا.
- برهان على كفاءة الطريقة في معالجة العينات.
- رؤى حول العمليات التنموية من خلال تحليل التعبير الجيني.
الاستنتاجات
- توفر هذه الطريقة طريقة قوية لدراسة تمايز الخلايا.
- تسهّل فهمًا أعمق لعلم الأحياء التنموي.
- إتقان التقنية يسمح بمعالجة سريعة للعينات.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Single-cell isolation and gene expression profiling from zebrafish embryos enables high-resolution analysis of cellular heterogeneity during early vertebrate development. This capability supports mechanistic de-risking and target validation by revealing transcriptional diversity and intermediate differentiation states. Integrating these workflows at the discovery stage enhances predictive confidence for downstream portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of developmental gene expression at the single-cell level for pathway clarification.
- Supports biological de-risking by distinguishing progenitor and differentiating cell populations.
- Facilitates functional target validation through unbiased detection of cellular heterogeneity.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell suspensions for high-throughput multiplexing and sequencing assays.
- Standardizes cell isolation and viability assessment for reproducible downstream workflows.
- Enables quantitative gene expression readouts for robust assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant developmental models for translational biomarker discovery.
- Provides continuity from early discovery to preclinical validation by enabling transcriptomic profiling of defined cell types.
- Supports risk-adjusted advancement by clarifying cellular responses to genetic or chemical perturbations.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions single-cell analysis at the interface of early discovery and lead identification, supporting hypothesis testing and mechanistic de-risking in vertebrate models.
- Discovery Biology: Reveals transcriptional changes during specification and differentiation for pathway analysis.
- Screening: Delivers standardized, viable single-cell preparations for multiplexed gene expression assays.
- Analytics: Provides quantitative gene expression data and heterogeneity metrics for comparative analysis.
- Translational Research: Enables alignment of developmental gene expression signatures with disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable workflow for diverse cell types and genetic backgrounds in zebrafish.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in developmental studies.
- Operational Value: Standardizes single-cell isolation and analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying cellular heterogeneity and differentiation trajectories.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and models for advancement.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in zebrafish handling, cell dissociation, and microfluidics.
- Needs access to fluorescence-activated cell sorting and microfluidic capture platforms.
- Demands rigorous cross-team standardization for cell viability and gating strategies.
- Adaptable to various transgenic lines and developmental stages with appropriate markers.
- Dependent on careful optimization to ensure single-cell capture and minimize technical variability.
