تحويل جينية كطريقة آمنة وبسيطة للحصول على خلايا إفراز الأنسولين من الخلايا الليفية الجلد الكبار

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحويل الخلايا الليفية إلى خلايا تفرز الأنسولين دون إحداث تعدد القدرات أو استخدام نواقل رجعية الحيوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الطب التجديدي وخاصة في العلاج الخلوي لمرض السكري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا الحصول على مفتاح في النمط الظاهري دون إحداث حالة مستقرة متعددة القدرات في الخلايا المحولة وبدون نواقل الفيروسات القهقرية.

ستظهر الإجراء جورجيا بيناروسا ، طالبة ما بعد الدكتوراه في مختبرنا. لبدء هذا الإجراء ، أضف 1.5 مل من جيلاتين الخنازير المعقمة 0.1٪ إلى أطباق بتري مقاس 35 ملم واترك الطلاء لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل خزعات جلد الإنسان باستخدام PBS المكمل بمحلول مضاد للفطريات مضاد للمضادات الحيوية بنسبة 2٪.

بعد ذلك ، ضع الخزعات في طبق بتري 100 ملم وقم بتقطيعها إلى شظايا ملليمترين مكعبتين تقريبا بمشارط معقمة. بعد ذلك ، ضع خمسة إلى ستة شظايا من الجلد في طبق بتري المطلي مسبقا مقاس 35 ملم. أضف قطرة من وسط الخلايا الليفية فوق كل جزء وزرعها عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد ستة أيام من الحضانة ، تخلص من شظايا الأنسجة بعناية. يجب أن تبدأ الخلايا الليفية في النمو من شظايا الأنسجة وتبدأ في تكوين طبقة أحادية الخلية. في هذا الإجراء ، قم بزراعة الخلايا الليفية عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى التقاء 80٪.

ثم ضع الخلايا في أطباق ثقافة جديدة. زرعها عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون وحافظ على نسبة المرور بين واحد إلى اثنين وواحد إلى أربعة ، اعتمادا على معدل النمو. بعد ذلك ، أضف 0.1٪ جيلاتين الخنازير إلى أطباق زراعة الخلايا واترك الطلاء لمدة ساعتين.

قم بإزالة محلول الطلاء الزائد قبل 10 إلى 30 دقيقة من طلاء الخلايا الليفية. ثم قم بإزالة وسط ثقافة الخلايا الليفية من أطباق الاستزراع. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS المكمل بمحلول مضاد للفطريات مضاد للمضادات الحيوية بنسبة 1٪.

ثم أضف طبقة رقيقة من محلول Trypsin-EDTA. احتضنها عند 37 درجة مئوية حتى تبدأ الطبقة الأحادية للخلية في الانفصال عن قاع طبق زراعة الأنسجة وتنفصل الخلايا. بعد ذلك ، قم بتخفيف تعليق الخلية بتسعة أجزاء من وسط زراعة الخلايا الليفية من أجل تحييد عمل التربسين.

بعد ذلك ، عد الخلايا باستخدام غرفة العد تحت المجهر في درجة حرارة الغرفة. احسب حجم وسط زراعة الخلايا الليفية المطلوب لإعادة تعليق الخلايا والحصول على تركيز الخلية 7.8 في 10 إلى الأرومة الليفية الرابعة لكل سنتيمتر مربع. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 150 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا بحجم محسوب من وسط زراعة الخلايا الليفية. بعد ذلك ، قم بوضع الخلايا على أطباق جيلاتين مغلفة مسبقا بنسبة 0.1٪ وزرعها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم صفر ، قبل الاستخدام مباشرة ، قم بإعداد محلول مخزون 5-aza-CR عن طريق إذابة 2.44 ملليغرام من 5-aza-CR في 10 ملليلتر من وسط الجلوكوز العالي DMEM.

تعقيمه عن طريق الترشيح. بعد ذلك ، قم بتخفيف ميكرولتر واحد من محلول مخزون 5-aza-CR في مليلتر واحد من وسط زراعة الخلايا الليفية. لزيادة مرونة الخلية ، بعد 24 ساعة من طلاء الخلية ، قم بإزالة وسط الثقافة من الخلايا الليفية المصنفة.

أضف محلول مخزون ميكرومولار 5-aza-CR ، واستزراعه لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم الأول ، قم بإعداد HP الطازج المتوسط. بعد الحضانة باستخدام ميكرومولار واحد 5-aza-CR ، قم بإزالة الوسيط وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام وسيط HP لضمان شطف 5-aza-CR بعيدا.

بعد ذلك ، قم بدمج الخلايا الليفية المعالجة ب 5-aza-CR بوسط HP لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لمراقبة كفاءة علاج 5-aza-CR ، تحقق من وجود أي تغييرات مورفولوجية. يجب أن تفقد الخلايا التشكل الممدود النموذجي للأرومات الليفية وتكتسب شكلا دائريا أو بيضاوي أصغر مع نوى متضخمة.

في الأيام من الأول إلى السادس ، قم بإعداد محلول البنكرياس القاعدي ومحلول مخزون Activin A. بعد ذلك ، قم بزراعة الخلايا الليفية المعالجة 5-aza-CR في وسط بنكرياس القاعدي المكمل بمحلول مخزون Activin A لمدة ستة أيام عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون وتغيير الوسط يوميا. في الأيام السابعة إلى الثامنة ، قم بإعداد محلول مخزون حمض الريتينويك عن طريق إضافة 16.6 مل من DMSO إلى 50 ملليغرام من حمض الريتينويك.

زراعة الخلايا في وسط بنكرياس القاعدي المكمل بمحلول مخزون أكتيفين أ ومحلول مخزون حمض الريتينويك لمدة يومين عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون وتغيير الوسط يوميا. في الأيام من التاسع إلى 36 ، قم بزراعة الخلايا والوسط القاعدي البنكرياس المكملة بمحلول مخزون ITS و B27 و BFGS وقم بتغيير الوسط يوميا لأول 15 يوما وتحديث الوسط كل يومين من اليوم 16 فصاعدا. استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

يوضح هذا الشكل التغيرات المورفولوجية التي تحدث أثناء تمايز البنكرياس الغدد الصماء. بعد سبعة أيام من التحريض ، تنظم الخلايا البشرية تدريجيا في مجموعات. استجابة لإضافة حمض الريتينويك ، يعيدون ترتيبهم في نمط شبكي ويتجمعون في مجاميع يمكن تمييزها.

تتقدم هذه التكوينات بمرور الوقت ، وتجنيد الخلايا وتجمع مستعمرات ثلاثية الأبعاد الموسعة. أخيرا ، تصبح المستعمرات هياكل كروية تميل إلى الانفصال وتتدفق بحرية في وسط الثقافة ، تذكرنا بجزر البنكرياس النموذجية في المختبر. بعد 36 يوما من تحريض البنكرياس ، عادت مستويات مثيلة الحمض النووي العالمية للخلايا المحولة اللاجينية البشرية إلى تلك التي لوحظت في الخلايا الليفية غير المعالجة.

لوحظ التوطين المشترك ل PDX1 مع CPEP في نهاية فترة التحويل بينما تكون علامات البنكرياس الغدد الصماء غائبة تماما في الخلايا الليفية غير المعالجة. يوضح هذا الرسم البياني كمية إطلاق الأنسولين من الخلايا المحولة اللاجينية استجابة للتعرض ل 20 ملليمولار D-glucose و 20 ملليمولار L-glucose. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في 38 يوما إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد تطويره ، مهد هذا البحث الطريق للباحثين في مجال الطب التجديدي لاستكشاف العلاج الخلوي لمرض السكري في الإنسان. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحويل الخلايا الليفية إلى خلايا تفرز الأنسولين دون إحداث تعدد القدرات أو استخدام نواقل الفيروسات القهقرية.