تحديد الظروف الحرجة لالمناعية في البازلاء المن الأجنة: زيادة نفاذية الأنسجة وتقليل خلفية تلطيخ

الهدف العام من بروتوكول التصبيغ المناعي هذا هو الكشف عن التعبير البروتيني في أجنة المن. تم تحديد ظروف حرجة تعمل على زيادة نفاذية الأنسجة وتقليل التصبيغ الخلفي، وكلاهما يمثل مشكلات قائمة منذ فترة طويلة عند تصبيغ الأنسجة الجنينية للمن. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها توفر ظروفاً محددة لضمان النفاذ الفعال للأجسام المضادة والحد من التصبيغ الخلفي، وهي أمور عادة لا يتم وصفها في بروتوكولات التصبيغ المناعي القياسية.

لقد خطرت لنا فكرة هذا المقياس لأول مرة عندما كنا ندرس كيفية تحديد الخلايا الجرثومية في مَنّ البازلاء، وهو نوع من النماذج الحشرية المستخدمة في الدراسات الجينومية والبيئية. وقد جُمعت السلالة المختبرية لـ مَنّ البازلاء، *A. pisum*، في الأصل من وسط تايوان، وجرى تربيتها على النباتات المضيفة لأكثر من 300 جيل.

من أجل الإنبات، انقع بذور النباتات المضيفة في ماء الصنبور لمدة تتراوح من ثلاثة إلى خمسة أيام في درجة حرارة الغرفة. استبدل الماء بماء عذب مرة واحدة يومياً. ازرع عشر بذور منبتة في وعاء صغير يحتوي على تربة داخل غرفة النمو تحت فترة ضوئية تبلغ 16 ساعة من الضوء وثماني ساعات من الظلام، عند درجة حرارة 20 °C.

بعد حوالي 10 أيام من بدء النمو، عادة ما يتجاوز ارتفاع النباتات ثمانية سنتيمترات. ضع كل أصيص من النباتات داخل دورق زجاجي سعة 1 لتر، وانقل حشرات المن البالغة إلى النباتات باستخدام فرشاة رسم. بعد ذلك، أغلق الدورق بغطاء نفاذ للهواء، مثل شبكة الشاش، لمنع هروب حشرات المن.

يتم تحضين حشرات المن في غرفة نمو تحت فترة ضوئية تبلغ 16 ساعة من الضوء وثماني ساعات من الظلام، عند درجة حرارة 20 °C، مع ري كل أصيص من النباتات مرة واحدة يومياً. يتم ملء بئر واحدة من لوحة التنقيط بنحو 500 µL من البارافورمالديهايد بتركيز 4%. توضع اللوحة تحت مجهر ستيريو بتكبير منخفض، ثم تُغمر حشرة من البالغين في البارافورمالديهايد لإجراء عملية التشريح.

قم بتشريح المبيضين عن طريق تثبيت الرأس والبطن باستخدام مجموعة واحدة من الملاقط، ثم قص القشيرة الظهرية للبطن وسحب المبيضين بعيدًا عن تجويف البطن. بعد ذلك، قم بتثبيت ثلاثة أزواج من المبيضين في أنبوب سعة 1.5 milliliter يحتوي على 1 milliliter من paraformaldehyde في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة، مع الرج الخفيف باستخدام جهاز خلط. تخلص من محلول التثبيت باستخدام قطارة زجاجية، ثم اغسل المبيضين بمحلول PBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق، مع الرج الخفيف.

لمعالجة المبيضين، يتم أولاً تحضينهما مع Proteinase K لمدة 10 دقائق مع الرج الخفيف لزيادة نفاذية الأنسجة الجنينية. بعد التحضين، يتم التخلص من محلول Proteinase K، ثم غسل المبيضين بـ 700 µL من glycine ثلاث مرات لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، يتم غسل المبيضين بـ PBST مرتين لمدة 10 دقائق.

قم بتثبيت المبيضين مرة أخرى باستخدام محلول التثبيت لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الرج الخفيف. ولتثبيط نشاط بيروكسيديز الداخلي، قم بإجراء تجفيف تسلسلي للمبيضين باستخدام نسب مئوية مختلفة من الميثانول في PBST بتركيز 0.2% وبنسب حجمية تبلغ 1:3، و1:1، و3:1، ثم قم بحضن المبيضين لاحقاً في ميثانول بتركيز 100% لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الرج الخفيف. بعد ذلك، قم بإعادة ترطيب المبيضين تسلسلياً، وفقاً للتعليمات الواردة في البروتوكول النصي.

بالنسبة لثلاثة أزواج من المبيضان في أنبوب سعة 1.5 milliliter، يبلغ الحد الأدنى للحجم المطلوب لحجب العينة وتلوين الأجسام المضادة 200 microliters. يتم تحضين المبيضان مع محلول حجب 1x DIG-B لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة، أو طوال الليل في درجة حرارة 4 °C، مع الرج الخفيف. بعد انتهاء التحضين، يتم التخلص من السائل الطافي واستبداله بمحلول حجب 1x DIG-B جديد، يحتوي على الجسم المضاد الأولي بنسبة التخفيف المناسبة.

يتم صبغ المبيضين لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة، أو طوال الليل في درجة حرارة 4 °C مع رج خفيف. بعد غسل المبيضين كما هو موضح في البروتوكول النصي، تخلص من الراشح واستبدله بمحلول 1x DIG-B blocking طازج يحتوي على الجسم المضاد الثانوي بنسبة التخفيف المناسبة، ثم قم بصبغ المبيضين كما سبق. بالنسبة للصبغ المناعي الفلوري، يتم إجراء عملية الصبغ في الظلام لأن الجسم المضاد الثانوي حساس للضوء.

يختلف سمك أجنة المن حسب مراحل النمو. وبناءً على ذلك، يتم تعديل استراتيجيات التثبيت لتناسب الأجنة في مراحلها المبكرة والمتوسطة والمتأخرة. انقل المبيضين، مع وسط التثبيت، إلى وعاء الخلايا باستخدام قطارة بلاستيكية، وافحص العينات تحت مجهر ستيريوسكوبي بتكبير منخفض.

اقطع الثآليل المرتبطة بـ lateral oviduct باستخدام دبابيس الحشرات، ثم انقل ovariole معزولة إلى بئر زجاجية فارغة باستخدام قطارة. أكمل الحجم النهائي ليصل إلى ما بين 50 و100 microliters باستخدام وسط التثبيت. بعد ذلك، انقل ovariole إلى الشريحة باستخدام قطارة زجاجية.

قم بتشريح غرف البيض باستخدام دبابيس الحشرات. بالنسبة للأجنة التي تجاوزت المرحلة السادسة من النمو، يُقترح فصل غرف البيض. أما بالنسبة للمناسل وغرفتي البيض الأوليين، فإن عملية الفصل اختيارية.

انقل حجرة بيض مُشرحة إلى شريحة نظيفة باستخدام قطارة زجاجية. وبالنسبة للأجنة في مراحل النمو من 1 إلى 10، ضع غطاء الشريحة ببطء فوق المبيضات أو حجرات البيض المُشرحة لتجنب تكون الفقاعات. وبدلاً من ذلك، بالنسبة للأجنة في مراحل النمو من 11 إلى 18، ثبت حجرات البيض على شريحة باستخدام جسر من غطاء شريحة أحادي الجانب، ثم ضع غطاء شريحة آخر فوق العينة.

بالنسبة للأجنة التي تتجاوز المرحلة 19 من التطور، يتم تثبيت غرف البيض على شريحة باستخدام جسر من غطاء الشريحة ثنائي الوجه، ثم يوضع غطاء شريحة آخر فوق العينة. بعد ذلك، يتم ملء الفراغ الموجود أسفل غطاء الشريحة العلوي بوسط التثبيت لتجنب جفاف العينة. يتم تدوير غطاء الشريحة العلوي برفق للحصول على التوجيه الصحيح للملاحظة.

أخيراً، قم بإحكام سد الحواف حول شرائح التغطية، بما في ذلك شرائح تغطية الجسر، باستخدام طلاء الأظافر قبل إجراء تحليل الصور، كما هو موضح في البروتوكول النصي. يظهر هنا زوج من المبايض تم تشريحها من أنثى بالغة. يتكون المبيض الصغير (ovariole) من جرِماريوم (germarium) واحد، وموقع واحد إلى موقعين من مواقع O-sites، بالإضافة إلى خمسة إلى سبعة أجنة، وجميعها تستقر داخل حجرات البيض بنمط خط تجميع.

بعد التثبيت باستخدام البارافورمالدهيد، يُوصى بشدة بهضم المبايض في محلول Proteinase K بتركيز 1 µg/mL لمدة 10 دقائق. وتظهر نتائج التلوين أن شدة الإشارة تزداد بشكل ملحوظ في الأجنة التي تم هضمها باستخدام Proteinase K. كما أن تحضين الأجنة في محلول الحجب المستمد من مجموعة منظمات DIG يقلل من تلوين الخلفية بشكل أكبر مما يفعله مصل الماعز الطبيعي وألبومين المصل البقري.

يمكن أن يؤدي النشاط الداخلي لإنزيم البيروكسيداز أيضاً إلى ظهور تلوين خلفي مرتفع. وتكشف هذه الدراسات أن غمر أجنة المن في الميثانول يمكن أن يثبط نشاط البيروكسيداز بكفاءة أكبر بكثير من معالجة الأجنة ببيروكسيد الهيدروجين. ويمكن تطبيق الظروف الحرجة التي كشفت عنها هذه الدراسة للكشف عن الإشارات في كل من الخلايا الجرثومية والخلايا الجسدية.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون يومين إذا طُبقت بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء صبغ مناعي ناجح على أجنة المن، بما في ذلك رفع شدة الإشارة وتقليل التصبغ الخلفي. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التعامل مع كل جنين برفق للحصول على شكل جيد للأجنة.

لا تنسَ أن التعامل مع البارافورمالدهيد وDAPI يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل ارتداء القفازات، أثناء تنفيذ هذا الإجراء. عقب هذا الإجراء، يمكن إجراء تدابير أخرى مثل التهجين الموضعي (in situ hybridization) للإجابة على أسئلة إضافية، مثل ما إذا كان الحمض النووي الريبوزي المرسال (messenger RNA) يتمركز مع ناتجه البروتيني في الخلايا الجنينية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال البيولوجيا البيئية للحشرات، مثل كيفية تحديد الخلايا الجرثومية، وكيفية تحديد خلايا البيض في مراحل تكاثرية متميزة في حشرات المن.