العزلة وتمايز الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة من الخنزير تحت الجلد الدهنية الأنسجة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الجذعية المشتقة من النسيج الدهني من الأنسجة الدهنية البيضاء تحت الجلد لدى الخنازير لتقييم قدرتها على التمايز إلى خلايا دهنية ميزنشيمية، وخلايا عظمية، وخلايا غضروفية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أبحاث السمنة، كما تعد أداة جيدة للكشف عن الآلية الجزيئية المعنية بتنظيم تطور النسيج الدهني.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية جمع عدد وفير من الخلايا السدويّة الوعائية، مما يسمح بإجراء تحليل معمق لتمايز الخلايا الدهنية وبيولوجيتها. وتكمن أهمية هذه التقنية في أبحاث العلاج بالخلايا الجذعية، حيث تظهر الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية للخنازير قدرة متعددة على التمايز إلى سلالات خلوية متعددة. ابدأ بوضع الخنزير الصغير في وضعية الانكفاء على طاولة جراحية نظيفة.

احلق جميع الشعر على طول الخط الناصف من الرقبة إلى الذيل، وافرك الجلد الظهري باستخدام Povidone iodine بتركيز 7.5% ثلاث مرات. بعد الفرك الثالث، اترك اليود على سطح الجلد لمدة 10 دقائق تقريبًا. ثم رش الجلد بـ ethanol بتركيز 70%.

واستخدم قطع شاش مبللة بالإيثانول لمسح الجلد في اتجاه واحد لإزالة المادة المطهرة حتى لا يظهر أي لون واضح. بعد ذلك، قم بإجراء شق من منطقة الرقبة وصولاً إلى الساق. ثم، مع رفع الدهون والجلد باستخدام الملاقط، استخدم المشرط لفصل طبقة الدهون الظهرية الخنزيرية من الأنسجة الدهنية تحت الجلد وطبقة الجلد الملاصقة لها عن العضلات.

اغمر الجلد وأنسجة الدهون على الفور في دورق معقم سعة 200-milliliter يحتوي على DMEM خالي من المصل عند درجة حرارة 37-degrees Celsius، ثم رش الجزء الخارجي من الدورق بـ 70%ethanol. بعد ذلك، ضع الدورق في غطاء تدفق رقائقي لزراعة الخلايا وضع غطاءً من رقائق الألومنيوم المعقمة ثلاثية الطبقات بمقاس 40 by 30-centimeter بجوار الدورق. انقل الأنسجة إلى فوق الرقائق بحيث يكون الجلد متجهاً للأسفل.

استخدم الملاقط والمقصات لتقليم ما تبقى من الأنسجة العضلية عن الأنسجة الدهنية. قطع الدهون إلى قطع مربعة بحجم 7 by 7-centimeter ثم انقل قطع الدهون إلى بيكر معقم جديد سعة 200-milliliter يحتوي على DMEM خالٍ من المصل عند درجة حرارة 37-degrees Celsius. الآن، ضع حامل شرائح مخصصاً، مزوداً بشفرة تقطيع من الفولاذ الكربوني فوق رقاقة الغطاء، وضع إحدى قطع الدهون على القاطع بحيث تكون طبقة الدهون مواجهة لأسفل.

قم بتقطيع الدهون إلى قطع بسمك 1 مليمتر تقريبًا، بحيث تكون قريبة قدر الإمكان من الجلد دون قطعه. بعد ذلك، استخدم المقص لفرم قطع النسيج الدهني بأقصى درجة ممكنة، ثم أضف القطع إلى دورق إرلنماير سعة 250 مليلتر يحتوي على وسط هضم مُرشح ومُدعم بإنزيم collagenase. قم بحضن الدورق مع التدوير لمدة 90 دقيقة بسرعة 45 RPM، وذلك في هزاز مداري عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

عندما يتحول وسط الهضم إلى ملاط، دون وجود تكتلات نسيجية ملحوظة، يتم إيقاف عملية الهضم بإضافة حجم مساوٍ من وسط استزراع يحتوي على DMEM F-12 مع 10%FBS. ولجمع الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية للخنازير، يتم ترشيح معلق الأنسجة الدهنية المهضومة عبر طبقة واحدة من الشيفون في زجاجة سيرولوجية معقمة سعة 250-milliliter، مع استخدام ملقط للضغط على منتصف الشيفون لتوجيه وتسهيل مرور المادة المهضومة. ثم يتم تصفية الشيفون وعصره باستخدام الملقط لإتمام عملية المرور، وتوزيع الوسط على أربعة أنابيب طرد مركزي مخروطية سعة 50-milliliter.

اجمع الخلايا السدوية الوعائية عن طريق الطرد المركزي. بعد ذلك، قم بسكب السائل الطافي دون تحريك الراسب لإزالة معظم طبقة الدهون العلوية التي تحتوي على الخلايا الدهنية الناضجة. تلي ذلك إعادة تعليق الراسب في 10 milliliters من DMEM باستخدام الماصة والرج اللطيف.

قم بطرد الخلايا مركزياً مرة أخرى وأعد تعليق الرواسب في 10 milliliters من محلول ACK lysis buffer. بعد سبع دقائق في درجة حرارة الغرفة، أوقف تحلل كريات الدم الحمراء بإضافة 10 milliliters من DMEM إلى كل أنبوب، مع رج الأنابيب بلطف للخلط. ثم، قم بطرد الخلايا مركزياً مرة أخرى.

اغسل الخلايا مرتين إضافيتين باستخدام 10 milliliters من DMEM، ثم اجمع السوائل الطافية عبر مصفاة 100 micron في أنبوب مخروطي واحد سعة 50 milliliters. استخدم الماصة برفق لنقل معلق الخلايا عدة مرات لتوزيع الخلايا بالتساوي، ثم قم بعد الخلايا باستخدام طريقة استبعاد Trypan Blue. أخيراً، ازرع الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية للخنازير بكثافة 6 × 10⁴ لكل centimeter-squared في وعاء زراعة مناسب الحجم باستخدام وسط زراعة الخلايا.

ثم تُحضن الخلايا عند 37 درجة مئوية و5%CO2، لتسهيل تكوين طبقة أحادية. وتتشابه مورفولوجيا الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية للخنازير والمستخلصة من الجزء الوعائي السدى مع الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية للفئران أو البشر، حيث لوحظ مورفولوجيا ممتدة تشبه الألياف الزجاجية بعد 24 ساعة من الاستزراع. وتصبح الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية للخنازير متلاحمة خلال 72 ساعة، وفي هذه المرحلة تكون جاهزة للتمايز إلى خلايا دهنية أو أنواع أخرى من التمايز الميزنكيمي.

تُظهر هذه الخلايا أيضاً قدرة قوية على التمايز الشحمي بعد الحث الكيميائي، ويمكن ملاحظة الخلايا الشحمية الناضجة بعد تسعة أيام من التمايز، حيث أظهرت أكثر من 90% من الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية للخنازير تمايزاً شحمياً. كما يُعبر عن علامات سطح الخلايا الجذعية الميزنكيمية، بما في ذلك CD 29 و CD 44 و CD 90 و MHC 1، بشكل كبير في الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية للخنازير، بينما بالكاد يمكن الكشف عن CD 4a و CD 31 و CD 45 و MHC II، مما يثبت أن هذه الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية للخنازير تمتلك خصائص من النوع الميزنكيمي دون تلوث ملحوظ بخلايا جذعية بطانية أو مكونة للدم. علاوة على ذلك، يمكن تحديد الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية للخنازير المتمايزة على أنها خلايا شحمية، أو خلايا عظمية، أو خلايا غضروفية، وذلك باستخدام صبغات صبغ الأنسجة النوعية، مما يثبت أن هذه الخلايا المشتقة من الجزء السدى الوعائي تحتفظ بتعدد القدرات النموذجي للأسلاف من النوع الميزنكيمي.

أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر اتباع تقنية تعقيم جيدة لاستنبات الخلايا وتنفيذ جميع الخطوات بأسرع ما يمكن، وذلك لزيادة حيوية الخلايا إلى الحد الأقصى. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن حصاد الخلايا من خنزيرين إلى ثلاثة خنازير في غضون ست ساعات، إذا نُفذت التقنية بشكل صحيح.

مهدت هذه التقنية المعيارية الطريق لباحثي السمنة في مجال مرض السكري لاستكشاف المفاتيح الجزيئية، مثل عوامل النسخ التي تتحكم في تمايز الخلايا الدهنية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية للخنازير وتقييم القدرة المتعددة لهذه الخلايا على التمايز إلى خلايا دهنية، وخلايا عظمية، وخلايا غضروفية.