الفصل Immunomagnetic من Sca1 الدهون مستودع محددة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الجذعية الميزنشيمية الموجبة لـ Sca1 من وسادات دهنية مختلفة في الفئران. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنه من خلال استخدام فرز الخلايا القائم على الخرزات المناعية المغناطيسية، يمكن إثراء الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية من مستودعات دهنية مختلفة بشكل فعال لإجراء التجارب اللاحقة. وبشكل عام، قد يواجه الباحثون المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن قوة ومدة هضم الأنسجة بواسطة الكولاجيناز يجب تحسينهما للحصول على عدد كافٍ من الخلايا لعملية الفرز.

لعزل الوسائد الدهنية تحت الجلد، ابدأ بوضع الفأر على لوح تشريح رغوي في وضع الاستلقاء على الظهر ورش الحيوان بـ 70%ethanol. بعد تثبيت القوائم باللوح، قم بعمل شق صغير في جلد أسفل البطن. ثم، باستخدام الملقط للإمساك بطرف الشق، استخدم المقص لفصل الجلد والبريتون من البطن وصولاً إلى الصدر.

أجرِ شقوقاً جانبية في الجلد، على طول جانب الجسم، ثم اقلب الجلد بعيداً عن البريتون باتجاه الرأس. بعد ذلك، اسحب الجلد المتبقي مع إبعاد الدهون الإربية عن الجسم، واستخدم إبراً بقياس 22 gauge لتثبيت الجلد على اللوحة. تالياً، استخدم الملقط للإمساك بكتلة دهنية إربية واحدة من منشأها بالقرب من البريتون، واستخدم مقصاً دقيقاً للقص بين الجلد والدهون الإربية، وبالتحرك تدريجياً نحو الأربد، مع تجنب تلوث الكتلة الدهنية تحت الجلد بالجلد.

بعد ذلك، ضع الوسادة الدهنية الإربية المعزولة في طبق قطر 60 ملليمتر مُسمى بـ SQ يحتوي على وسط استزراع بدرجة حرارة 37 °C، ثم قم باستئصال الوسادة الدهنية الإربية من الجانب الآخر للحيوان بنفس الطريقة. ولعزل الوسادات الدهنية الحشوية، قم بقطع البريتون للكشف عن الوسادات الدهنية الحشوية والأمعاء، ثم أزِح الأمعاء جانباً باتجاه الصدر.

أمسك وسادة الدهون الحشوية عند الطرف القاصي، واسحب نسيج الدهون بلطف للأعلى، ثم قم بتشريحه وإخراجه، مع الحرص على استبعاد نسيج البربخ. بعد ذلك، ضع وسادة الدهون في طبق بقطر 60 مليمتر يحمل ملصق VIS ويحتوي على وسط زراعة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. وعندما يتم جمع كل وسادات الدهون، انقل الأطباق إلى غطاء زراعة الأنسجة، واشفط الوسط.

استخدم مقصات منحنية لتقطيع الوسادات إلى قطع صغيرة. بعد ذلك، أضف قطع الدهون إلى أنابيب سعة 50 milliliter منفردة تحتوي على كولاجيناز مُحضّر حديثًا. ثم قم برج الأنابيب بسرعة 300 RPM ودرجة حرارة 37 degrees Celsius لمدة تتراوح من 10 إلى 20 دقيقة، حتى يتم هضم الأنسجة.

قد تظل بعض قطع أنسجة الوسادة الدهنية تحت الجلد مرئية. أضف 20 milliliters من وسط الزرع إلى محلول الكولاجيناز لإيقاف عملية الهضم، واستخدم ماصة سيرولوجية سعة 10 milliliters لسحب وتوزيع ملاط الأنسجة 10 مرات لتفكيك الأنسجة المهضومة بالكامل. قم بترشيح الخلايا عبر مصافي خلايا بحجم 100 micron، ثم قم بطرد الأنسجة مركزياً.

بعد ذلك، قم بسكب الوسط بعناية، مع الحرص على عدم تحريك الراسبات، ثم أعد تعليق كلتا مجموعتي الخلايا برفق في خمسة ملليلتر من الماء المعقم. انتظر لمدة دقيقتين حتى تتحلل كريات الدم الحمراء. ثم أوقف التفاعل في كل أنبوب بإضافة 25 ملليلتر من الوسط المكمل بـ FBS.

قم بترشيح كلا مجموعتين من الخلايا الدهنية باستخدام مصافٍ خلوية جديدة بفتحات حجمها 100 micron، ثم قم بطردها مركزياً مرة أخرى، وبعد ذلك أعد تعليق الرواسب في مقدار يتراوح من 1 إلى 3 milliliters من الوسط الغذائي. وبعد إجراء العد باستخدام طريقة استبعاد صبغة trypan blue، قم بزراعة 1 × 10⁶ من خلايا الوسادة الدهنية تحت الجلد وخلايا الدهون الحشوية بشكل منفصل في آبار فردية من طبق زراعة خلايا مكون من ستة آبار. وبعد معالجة الخلايا بالتربسين، خفف التربسين باستخدام 1 milliliter من محلول الفصل المنظم، ثم قم بطرد أطباق الزراعة مركزياً.

نقوم بتعليق الخلايا في 500 µL لكل أنبوب من محلول الفصل المنظم، ثم نُطرد الخلايا مركزياً مرة أخرى. الآن، أعد تعليق الخلايا في 90 µL لكل أنبوب من محلول الفصل المنظم، وأضف 10 µL من الجسم المضاد الأولي anti-Sca1 FITC إلى معلق الخلايا. بعد تحضين الخلايا لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C في الظلام، اغسل الخلايا باستخدام 1 mL من محلول الفصل المنظم لكل أنبوب.

بعد الطرد المركزي، يتم إعادة تعليق الخلايا في 80 µL من منظم الفصل لكل معلق خلوي. بعد ذلك، يتم خلط 20 µL من Anti-FITC Microbeads في كل بئر، وتوضع الأطباق عند درجة حرارة 4 °C، مع حمايتها من الضوء لمدة 15 دقيقة. وفي نهاية فترة التحضين، تُغسل الخلايا في 1 mL من منظم الفصل، ثم يتم إعادة تعليق الخلايا في 500 µL من المنظم الجديد لكل أنبوب.

الآن، ضع عموداً في الحامل المغناطيسي، واشطف العمود بـ 500 microliters من محلول الفصل المنظم. انقل الخلايا من مستنبت أنسجة الوسادة الدهنية تحت الجلد إلى العمود، مع الحرص على تجنب تكون الفقاعات، واجمع خلايا Sca1 السلبية غير المسمى في أنبوبة مخروطية سعة 15 milliliter. وعندما تمر جميع الخلايا عبر العمود، اغسله ثلاث مرات بـ 500 microliters من محلول الفصل المنظم.

بعد ذلك، انقل العمود من المغناطيس إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 milliliter، ومرر one milliliter من محلول الفصل الطازج عبر العمود لاسترداد الخلايا الموجبة لـ Sca1. وأخيراً، قم بعملية الطرد المركزي لكل من كسور الخلايا الموجبة والسالبة لـ Sca1، وأعد تعليق الرواسب في one milliliter من وسط الزرع. ثم قم بعدّ الخلايا في كل كسر، وزع الكسور في آبار منفصلة في طبق زرع خلايا جديد يحتوي على ستة آبار.

تُظهر الخلايا السدوية الوعائية المعزولة من الدهون تحت الجلد شكلاً خلوياً ممدوداً يشبه الخلايا الليفية بغض النظر عن مستوى تعبير Sca1 فيها. ومثل الخلايا عالية التعبير عن Sca1 المشتقة من الدهون الأربية تحت الجلد، تُظهر الخلايا عالية التعبير عن Sca1 المشتقة من الدهون الحشوية في البربخ شكلاً خلوياً ممدوداً يشبه الخلايا الليفية، بينما تُظهر خلايا VIS منخفضة التعبير عن Sca1 شكلاً ظهارياً.

يمكن التعرف بسهولة على الخلايا ذات التعبير العالي لـ Sca1 والمعزولة من فئران Sca1-GFP كونها خلايا موجبة لـ GFP في المزارع النسيجية. وبالفعل، عند تقييم هذه الخلايا بواسطة قياس التدفق الخلوي، يتم التأكد من أن معظم الخلايا الموجبة لـ GFP تعبر عن بروتينات Sca1 على أسطح خلاياها، كما تم الكشف عنها بواسطة الجسم المضاد anti-Sca1. وبالاقتران مع تحليلات PCR في الوقت الحقيقي، يمكن إثبات التعبير التفاضلي لبروتينات ميتالوبروتينيز مصفوفية محللة للكولاجين بين الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية ذات التعبير العالي لـ Sca1 المستمدة من الدهون الإربية والدهون البربخية.

علاوة على ذلك، عند استخدام هلامات الكولاجين من النوع I الموصومة بـ fluorescein لتقييم نشاط التحلل حول الخلوي، يُلاحظ زيادة ملحوظة في نشاط إعادة تشكيل الكولاجين الذي تتوسطه الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية الحشوية ذات التعبير العالي عن Sca1. وبمجرد إتقان هذه الطريقة، يمكن إتمام عملية عزل خلايا الوسادة الدهنية في غضون ساعتين إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على مجال جراحي نظيف ومنظم لضمان عزل الوسادة الدهنية بكفاءة.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل مقايسة تحلل الكولاجين، للإجابة على أسئلة إضافية حول إعادة تشكيل الأنسجة بوساطة الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية. وقد مهدت هذه التقنية، بعد تطويرها، الطريق للباحثين في مجال السمنة وبيولوجيا المصفوفة لاستكشاف دور الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية في إعادة تشكيل الأنسجة الدهنية ووظائفها في الفئران والبشر. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية الحصول على الخلايا الأولية الموجبة لـ Sca1 من مستودعات الأنسجة الدهنية وإثرائها.