الفصل Immunomagnetic من Sca1 الدهون مستودع محددة ^عالية الدهنية المشتقة من الخلايا الجذعية (مخولا لصيانة طائرات)

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الجذعية الوسيطة الإيجابية Sca1 من وسادات دهون الفئران المختلفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه باستخدام الخلايا القائمة على الخرز المغناطيسي المناعي ، يمكن إثراء الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون من مستودعات الدهون المختلفة بشكل فعال للتجارب اللاحقة. بشكل عام ، سيكافح الباحثون الجدد في هذه الطريقة لأنه يجب تحسين قوة ومدة هضم الأنسجة بوساطة الكولاجيناز للحصول على عدد كاف من الخلايا للفرز.

لعزل ضمادات الدهون تحت الجلد ، ابدأ بوضع الماوس على لوح تشريح رغوي في وضع الاستلقاء ورش بنسبة 70٪ من الإيثانول. بعد تثبيت الكفوف على السبورة ، قم بعمل شق صغير في جلد أسفل البطن. ثم ، أمسك الجزء العلوي من الجرح بالملقط ، استخدم المقص لفصل الجلد والصفاق من البطن إلى الصدر.

عمل جروح جانبية في الجلد ، على طول جانب الجسم ، يعكس الجلد بعيدا عن الصفاق باتجاه الرأس. بعد ذلك ، اسحب الجلد المتبقي للخلف ، مع إبعاد الدهون الأربية عن الجسم ، واستخدم 22 إبرة قياس لتثبيت الجلد على السبورة. بعد ذلك ، استخدم الملقط للاستيلاء على وسادة دهنية إربية واحدة في أصلها بالقرب من الصفاق ، واستخدم مقصا دقيقا للقص بين الجلد والدهون الأربية ، والتقدم نحو الفخذ ، وتجنب تلويث وسادة الدهون تحت الجلد بالجلد.

بعد ذلك ، ضع وسادة الدهون الأربية المعزولة في طبق 60 ملم يحمل علامة SQ يحتوي على وسط استزراع 37 درجة مئوية ، واحصد وسادة الدهون الأربية من الجانب الآخر من بنفس الطريقة. لعزل ضمادات الدهون الحشوية ، قم بقطع الصفاق لفضح ضمادات الدهون الحشوية والأمعاء. ثم حرك القناة الهضمية جانبا باتجاه الصدر.

أمسك الوسادة الدهنية الحشوية في الطرف البعيد ، واسحب الأنسجة الدهنية برفق ، وقم بتشريحها ، مع الحرص على استبعاد الأنسجة البربخية. ثم ضع وسادة الدهون في طبق 60 ملم يحمل علامة VIS يحتوي على وسط استزراع 37 درجة مئوية. عندما يتم جمع كل ضمادات الدهون ، انقل الأطباق إلى غطاء مزرعة الأنسجة ، واستنشق الوسط.

استخدم مقصا منحنيا لفرم الفوط. ثم أضف القطع الدهنية إلى أنابيب فردية سعة 50 ملليلتر تحتوي على كولاجيناز طازج. بعد ذلك ، رج الأنابيب عند 300 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 20 دقيقة ، حتى يتم هضم الأنسجة.

قد تظل بعض القطع من أنسجة الوسادة الدهنية تحت الجلد مرئية. أضف 20 مل من وسط المزرعة إلى محلول الكولاجيناز لوقف الهضم ، واستخدم ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر لشفط ملاط الأنسجة وتوزيعه 10 مرات لفصل الأنسجة المهضومة بالكامل. قم بتصفية الخلايا من خلال مصافي خلايا 100 ميكرون ، وقم بالطرد المركزي للأنسجة.

ثم صب الوسط بعناية ، مع الحرص على عدم إزعاج الكريات ، وإعادة تعليق كلتا المجموعتين من الخلايا برفق في خمسة ملليلتر من الماء المعقم. انتظر دقيقتين حتى يتم تحلل كريات الدم الحمراء. ثم توقف التفاعل في كل أنبوب ب 25 مل من الوسط المكمل ب FBS.

قم بتصفية كل من مجموعات الخلايا الشحمية من خلال مصافي الخلايا الجديدة 100 ميكرون ، وقم بتدويرها مرة أخرى ، ثم أعد تعليق الكريات في واحد إلى ثلاثة ملليلتر من المتوسط. بعد العد عن طريق استبعاد التريبان الأزرق ، قم بوضع لوحة منفصلة واحدة في عشرة إلى خلايا الوسادة الدهنية تحت الجلد والخلايا الحشوية في آبار فردية من لوحة ثقافة الخلايا المكونة من ستة آبار. بعد تربسين الخلايا ، قم بتخفيف التربسين بمليلتر واحد من المخزن المؤقت للفصل ، ثم قم بالطرد المركزي لألواح الزاعقة.

نقوم بتعليق الخلايا في 500 ميكرولتر لكل أنبوب من المخزن المؤقت للفصل ، ونقوم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى. الآن ، أعد تعليق الخلايا في 90 ميكرولتر لكل أنبوب من المخزن المؤقت للفصل ، واخلط 10 ميكرولترات من الجسم المضاد الأساسي ل Sca1 FITC في تعليق الخلية. بعد 10 دقائق من الحضانة عند أربع درجات مئوية في الظلام ، اغسل الخلايا بملليلتر واحد من المخزن المؤقت للفصل لكل أنبوب.

بعد الغزل ، يتم إعادة تعليق الخلايا في 80 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفصل لكل معلق خلية. ثم امزج 20 ميكرولترا من الميكروبيدات المضادة للفيتكوين في كل بئر ، وضع الألواح على أربع درجات مئوية ، محمية من الضوء لمدة 15 دقيقة. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا في مليلتر واحد من المخزن المؤقت للفصل ، وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت الطازج لكل أنبوب.

الآن ، ضع عمودا في الحامل المغناطيسي ، واشطف العمود ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المنفصل. انقل الخلايا من مزرعة أنسجة الوسادة الدهنية تحت الجلد إلى العمود ، مع الحرص على تجنب الفقاعات ، وجمع الخلايا السالبة Sca1 غير المسمى في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. عندما تمر جميع الخلايا ، اغسل العمود ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفصل.

ثم انقل العمود من المغناطيس إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مليلتر ، وقم بغمر مليلتر واحد من المخزن المؤقت للفصل الطازج عبر العمود لتصفية الخلايا الموجبة Sca1. أخيرا ، قم بتدوير كل من كسور الخلايا الموجبة والسالبة من Sca1 ، وأعد تعليق الكريات في ملليلتر واحد من وسط الاستزراع. ثم احسب عدد الخلايا في كل جزء ، وقم بتقطيع الكسور في الآبار الفردية للوحة ثقافة الخلايا الجديدة المكونة من ستة آبار.

تظهر الخلايا اللحمية الوعائية المعزولة من الدهون تحت الجلد شكل خلية ممتدة تشبه الخلايا الليفية بغض النظر عن مستوى تعبير Sca1. مثل خلايا Sca1 المرتفعة المشتقة من الدهون الأربية تحت الجلد ، تظهر خلايا Sca1 المرتفعة المشتقة من الدهون البربخية الحشوية شكل خلية ممتدة تشبه الخلايا الليفية. في حين أن VIS Sca1 تظهر الخلايا المنخفضة شكلا ظهاريا.

يمكن التعرف بسهولة على الخلايا العالية Sca1 المعزولة من الفئران المعزولة Sca1-GFP على أنها خلايا إيجابية GFP في زراعة الأنسجة. في الواقع ، عندما يتم تقييم هذه الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي ، يتم تأكيد أن معظم الخلايا الإيجابية ل GFP تعبر عن بروتينات Sca1 على أسطح خلاياها ، كما تم اكتشافها بواسطة الجسم المضاد ل Sca1. إلى جانب تحليلات تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، يمكن إثبات التعبير التفاضلي للبروتينات المعدنية المصفوفة الكولاجينية بين الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون الإربية والبربخية Sca1 المشتقة من الدهون العالية.

علاوة على ذلك ، عندما يتم استخدام جل الكولاجين من النوع الأول المسمى بالفلورسين لتقييم نشاط التحلل حول الخلايا ، لوحظ زيادة ملحوظة في نشاط إعادة تشكيل الكولاجين بوساطة الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون العالية Sca1. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال عزل خلايا الوسادة الدهنية في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على مجال جراحي نظيف ومنظم لضمان عزل وسادة الدهون بكفاءة.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل مقايسة تحلل الكولاجين ، للإجابة على أسئلة إضافية حول إعادة تشكيل الأنسجة بوساطة الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال السمنة وبيولوجيا المصفوفة لاستكشاف دور الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون في إعادة تشكيل الأنسجة الدهنية ووظيفتها في الفئران والبشر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية شراء وإثراء الخلايا الإيجابية الأولية Sca1 من مستودعات الأنسجة الدهنية.