كشف في وقت واحد ج-فو التنشيط من مواقع مكافأة Mesolimbic والقشري المتوسطي الدوبامين بعد ساذج السكر والدهون الابتلاع في الجرذان

الهدف العام لهذا البروتوكول التجريبي هو تحديد ما إذا كان VTA ، ومناطق إسقاط DA ذات الدماغ المتوسط الرئيسية ستعرض تنشيطيا تنسيقيا ومتزامنا من c-Fos بعد تناول جديد من زيت الذرة أو الجلوكوز أو الفركتوز أو المحاليل السكرين. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل الدافع ، وتحديد ما إذا كانت مواقع الدماغ المتعددة يتم تنشيطها بطريقة منسقة استجابة للمنبهات المستساغة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تجمع بين المقايسات السلوكية المعمول بها وتقنيات التنشيط الخلوي والتحليلات الإحصائية.

لإعداد الجهاز ، استخدم أنبوب طرد مركزي معاير مع سدادة سارق ، وأنبوب شفق معدني بزاوية 45 درجة لتوفير قياس دقيق للمحلول المقدم إلى الفئران. قم بتثبيته في قفص المنزل بواسطة زنبرك معدني مشدود ، وللسماح برؤية المعايرة. قبل ثلاثة إلى خمسة أيام من التدريب ، قم بقصر الحصص الغذائية على الفئران لتقليل وزن جسمه إلى 85٪ من وزنه الأصلي ، من أجل زيادة الدافع لاستهلاك المحلول.

في غضون ذلك ، قم بتوفير 10 ملليلتر من محلول ما قبل التدريب ، مع 0.2٪ سكرين ، للحيوان لمدة أربعة أيام ، على مدار جلسة مدتها ساعة واحدة ، لزيادة احتمالية قيام الفئران بأخذ عينات من محلول الاختبار اللاحق بزمن انتقال قصير. قم بوزن الأنبوب قبل وبعد كل جلسة للحصول على قياس المدخول بعد ذلك ، قم بإجراء اختبار المدخول في اليوم الخامس على المجموعات الفرعية التي تتلقى أحد الحلول الستة.

تأكد من أن الفئران تأخذ عينة من الحل بزمن انتقال قصير ، واستبعاد الأشخاص من الدراسة إذا لم يتم استيفاء هذا المطلب. لتحضير الأنسجة ، بعد التضحية بالحيوان ، قم بإزالة الدماغ من الجمجمة بسرعة. استخدم الجرجيرات لتكسير العظم وإزالته بعناية من الدماغ ، بدءا من الخلف إلى الأمام.

اعمل في المنطقة الواقعة أسفل المخيخ ، وتأكد من أن الأحجار الكريمة بين العظم والأم السحائية. بمجرد إزالة الجزء العلوي والجانبي من الجمجمة ، استخدم ملعقة صغيرة لرفع الدماغ من قاعدته ، وقص الأعصاب القحفية بمقص صغير. بعد ذلك ، قم بإصلاح الدماغ في محلول بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية.

في اليوم التالي ، ضع الدماغ في محلول السكروز في درجة حرارة الغرفة ، حتى يستقر في قاع الحاوية. بعد ذلك ، قم بإزالة البصلة الشمية. بعد ذلك ، قم بإزالة المخيخ والجرذ.

بعد ذلك ، قم بتركيب الدماغ بشكل إكليلي ، مع تثبيت الجزء الذيلي على مرحلة الميكروتوم ، وقطع الأقسام الإكليلية التي يبلغ طولها 40 ميرومتر. في هذا الإجراء ، عالج الأقسام بخمسة ملليلتر من مصل الماعز العادي بنسبة 5٪ ، و 0.2٪ Triton x-100 في PBS ، لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم باحتضان الأقسام المعالجة بجسم مضاد أولي عند أربع درجات مئوية لمدة 36 ساعة ، في الآبار التي تحتوي على مليلتر واحد من PBS.

بعد 36 ساعة ، اشطف الأقسام ثلاث مرات بخمسة ملليلتر من PBS لمدة 10 دقائق في كل مرة. بعد ذلك ، احتضان الأقسام بجسم مضاد ثانوي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ، في الآبار التي تحتوي على مليلتر واحد من PBS. بعد ذلك ، اشطف الأقسام ثلاث مرات في خمسة ملليلتر من PBS لمدة 10 دقائق في كل مرة.

بعد ذلك ، قم باحتضان الأقسام المغسولة لمدة ساعتين في خليط أفيدين الفجل الحار بيروكسيداز المتوفر تجاريا. بعد ساعتين ، اشطف الأقسام ثلاث مرات في خمسة ملليلتر من PBS ، لمدة عشر دقائق في كل مرة. بعد ذلك ، تفاعل الأقسام مع DAB في وجود بيروكسيد الهيدروجين ، لمدة خمس إلى عشر دقائق.

بعد ذلك ، قم بتسمية أقسام VTA مرتين عن طريق احتضانها بجسم مضاد للتيروزين هيدروكسيلاز ، في خمسة ملليلتر من PBS ، بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، اشطف الأقسام ثلاث مرات في خمسة ملليلتر من PBS ، لمدة عشر دقائق في كل مرة. بعد ذلك ، احتضان الأقسام ذات الأجسام المضادة الثانوية في خمسة ملليلتر من PBS ، في درجة حرارة الغرفة ، لمدة ساعتين.

بعد ساعتين ، اشطف الأقسام ثلاث مرات في خمسة ملليلتر من PBS ، لمدة عشر دقائق في كل مرة. لتصور الجسم المضاد باستخدام مركب بيروكسيداز الأجسام المضادة الثانوية ، تفاعل معه بمزيج من DAB ، ومحلول كبريتات النيكل 0.3٪ ، لمدة خمس إلى عشر دقائق. عد الخلايا بالنقر المزدوج فوق رمز البرنامج.

انتقل إلى شريط القائمة ، وانقر فوق اكتساب ، ثم Live Image. بعد ذلك ، قم بتركيز منطقة الاهتمام ، وانقر فوق الشاشة لإنشاء نقطة مرجعية. بعد ذلك ، انتقل إلى شريط أدوات الشبكة ، وانقر فوق شبكة العرض ، واستخدم تسميات الشبكة.

حدد منطقة الاهتمام بتتبع محدد مسبقا. بعد ذلك ، قم بحساب جميع الخلايا في كل منطقة ذات اهتمام ، وحدد زائد في الشريط الجانبي الأيسر لتسجيل أعداد خلايا c-Fos. ضع في اعتبارك خلية موجبة ل c-Fos عند ملاحظة دائرة حمراء داكنة محددة.

كرر هذه العملية لكل موقع ، وتأكد من أن الموثوقية بين المقيمين غير المطلعين لكل قسم في كل منطقة ذات أهمية ، تتجاوز دائما 0.8. بعد ذلك ، احسب الخلايا العصبية الإيجابية c-Fos في مناطق الاهتمام. حدد ما إذا كان النشاط المناعي c-Fos موجودا في الخلايا الإيجابية TH والسلبية TH في VTA.

توضح هذه الصورة أن تناول الدهون أو السكر يزيد بشكل تفاضلي من تنشيط c-Fos في اللوزة الدماغية بأكملها ، وكذلك في المناطق الفرعية اللوزة القاعدية الجانبية والوسطى القشرية الإنسية. في هذه الصورة ، لوحظ تنشيط اللوزة الفعلي c-Fos في المعرضة لتناول زيت الذرة والجلوكوز والفركتوز. كما لوحظ تنشيط C-Fos في VTA في المعرضة لزيت الذرة والماء.

تشير الأسهم السوداء إلى الخلايا الإيجابية التمثيلية ذات التسمية المزدوجة TH c-Fos ، بينما تشير الأسهم الرمادية إلى الخلايا التمثيلية c-Fos فقط. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ثلاثة إلى أربعة أسابيع ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر اتباع منهجية دقيقة والتخزين والعد.

شكرا على المشاهدة ، ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.