في المختبر التفكيك من الأنفلونزا من الفيروسات Capsids بواسطة الطرد المركزي التدرج

الهدف العام من هذا الطرد المركزي المتدرج للسرعة هو تحليل قفيصة فيروس الأنفلونزا A في ظل ظروف تحاكي البيئة الداخلية التي تواجهها الفيروسات الواردة أثناء دخول الخلية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول كيفية تفكك قفيصة فيروس الإنفلونزا A أثناء دخول الخلية، مثل التأثير المحدد لدرجة الحموضة الحمضية المعتدلة على استقرار القفيصة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتيح التحليل الكمي لعملية تفريغ فيروس الأنفلونزا A في ظل ظروف تجريبية محددة.

إلى جانب توفير رؤى حول كيفية بدء فتح فيروس الأنفلونزا A ، يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على دراسة فيروسات المغلف الأخرى ذات آليات فك الطلاء ذات الصلة. يوضح الإجراء فرات نيبلوغلو ، وهو طالب سابق من مختبري. بعد تحضير مخازن المخزون والكواشف وفقا لبروتوكول النص ، لكل حالة من حالات الأس الهيدروجيني لاختبار ، قم بإعداد مزيج رئيسي للمخزن المؤقت للمنظفات عن طريق خلط تسعة ملليلتر من كلوريد الصوديوم المولي ، وستة ملليلتر من 10٪ NP40 ، و 2.4 مل من مخزون مثبطات البروتياز 25X ، وتسعة ملليلتر من الماء المقطر المزدوج.

ثم لكل حالة من حالات الأس الهيدروجيني ، تمزج 4.4 ملليلتر من الأنابيب الرئيسية في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. بالنسبة لقيم الأس الهيدروجيني التي تزيد عن 5.8 ، أضف 0.6 مل من محلول مخزون 500 مللي مولار تريس المعدل بدرجة الحموضة إلى الأنبوب. بالنسبة لقيم الأس الهيدروجيني 5.8 وأقل ، أضف 0.6 مل من محلول مخزون MES 500 مللي مولار المعدل بدرجة الحموضة.

اصنع خمسة ملليلتر من المحلول العازل ، يحتوي على 300 ملكلوريد الصوديوم المولي ، ومثبط البروتياز 2X ، و 60 مللي مولار تريس ، معدل إلى درجة الحموضة 7.4 ، والماء المقطر المزدوج. سيكون هذا بمثابة مخزن مؤقت للتدرج الخالي من المنظفات. بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من مخزون الجلسرين بنسبة 50٪ إلى خمسة ملليلتر من المخاليط العازلة المحتوية على المنظفات والخالية من المنظفات ، مما ينتج عنه ستة محاليل جلسرين مختلفة بنسبة 25٪.

استخدم شرائط الأس الهيدروجيني للتحقق من قيم الأس الهيدروجيني. قم بإعداد محلول الجلسرين بنسبة 15٪ عن طريق خلط نسبة ثلاثة إلى سبعة من 50٪ مخزون الجلسرين مع الماء المقطر. باستخدام حقنة سعة خمسة ملليلتر وإبرة ، أضف ثلاثة ملليلتر من محلول الجلسرين بنسبة 15٪ إلى ستة أنابيب طرد مركزي فائقة الوضوح.

اغسل الإبرة بالماء المقطر المزدوج بعد كل خطوة. استخدم حقنة سعة خمسة ملليلتر وإبرة طويلة لحقن 3.4 مل من محلول الجلسرين بنسبة 25٪ تحت طبقة الجلسرين بنسبة 15٪ ، مع الحرص على عدم خلط الطبقتين. تظهر الواجهة بين كلتا الطبقتين بوضوح.

كرر هذا لجميع الحالات الستة للاختبار باستخدام محاليل الجلسرين المعدلة بدرجة الحموضة المعنية. بعد ذلك ، في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية ، استخدم ملليلترا واحدا من سائل الألانتويك المصفى والمخفف ، الذي يحتوي على فيروس الأنفلونزا A ، لتراكب تدرجات الجلسرين برفق. قم بنقل الأنابيب إلى دلاء دوار ، وقم بموازنة الأنابيب المتعارضة ، وضعها بعناية في دوار الطرد المركزي الفائق SW-41 المبرد مسبقا.

جهاز طرد مركزي عند 2100 دورة في الدقيقة و 12 درجة مئوية لمدة 150 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، استخدم ماصة باستور نظيفة وشفاطة لإزالة طبقتي الجلسرين بعناية. ثم باستخدام 40 مل من المخزن المؤقت لعينة LDS غير المختزلة 1X ، قم بإعادة تعليق الحبيبات تماما عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل قبل نقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.

لإجراء SDS-PAGE ، قم بتسخين جميع العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بتحميل 20 ميكرولترا من الكريات الذائبة على جل صغير متدرج مسبق الصب Bis-Tris وقم بتشغيله بسرعة 200 فولت لمدة ساعة واحدة في 1X MOPS SDS قيد التشغيل. احتضان الجل في محلول التثبيت لمدة ساعة واحدة.

اشطفها مرة إلى مرتين بالماء ، وصمة عارها طوال الليل في طبق زراعة خلية بحجم 15 سم مع كمية كافية من محلول Coomassie الغروي مع رجها برفق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة الجل في الماء المقطر بشكل مزدوج ، واستبدل السائل كل 15 إلى 20 دقيقة حتى تصبح خلفية الهلام واضحة. قم بتخزين الجل في ماء مقطر مزدوج عند أربع درجات مئوية حتى يتم مسحه ضوئيا لقياس الشريط الكمي.

أخيرا ، امسح الجل بدقة عالية واستخدم برنامجا مخصصا متاحا تجاريا لقياس كثافة نطاق البروتين. اطرح إشارة الخلفية من منطقة قريبة من النطاقات المعنية وقم بتطبيع القيم إلى قيم التحكم الخالية من المنظفات. في هذه التجربة ، تم إخضاع X31 المشتق من سائل الألانتويك المصفى لطرد مركزي متدرج السرعة عند مستويات الأس الهيدروجيني بين 7.4 و 5.0 وتم تحليله بواسطة SDS-PAGE.

بدون منظف موجود في التدرج ، يتم تكوير الفيروسات السليمة كما ينعكس في النمط المميز للنطاقات ، والتي تمثل HA و NP و M1 في الجل الملون بالكوماسي. عند إضافة NP40 إلى طبقة الجلسرين السفلية ، تم إذابة الغلاف الفيروسي ، بما في ذلك HA و NA و M2 ، وتم ترسيب اللب الفيروسي وحده في الحبيبات أثناء الطرد المركزي الفائق. بدءا من درجة الحموضة أقل من 6.5 ، يتم فقد M1 تدريجيا من جزء الحبيبات ، ويصل إلى الحد الأدنى بين الرقم الهيدروجيني 5.8 ودرجة الحموضة 5.4.

أقل من الرقم الهيدروجيني 5.8 ، تم فصل vRNPs وبالتالي فقدت من الحبيبات. من نطاقات البروتين التي تم تحليلها ، تم الكشف عن عتبة مميزة للأس الهيدروجيني لتفكيك طبقة M1 وتفكك حزم vRNP ، بما في ذلك الرقم الهيدروجيني 6.5 ودرجة الحموضة 5.8 ، على التوالي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه اعتمادا على سلالة أو متحولة معينة من فيروس الإنفلونزا A ، يمكن ملاحظة خصائص تفكيك مختلفة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل المجهر الإلكتروني من أجل الحصول على رؤى إضافية مثل بنية قفيصة فيروس الأنفلونزا المعزولة.