تطبيقات أحادية التحقيق: وسائل التصوير الطيفي والتحليل خلية واحدة في ظل الظروف المحيطة

الهدف العام من هذه الطريقة هو إنشاء جهاز أخذ عينات دقيق ، المسبار الفردي ، لتحليل الخلايا المفردة الحية باستخدام قياس الطيف الكتلي في ظل الظروف المحيطة. وإجراء تصوير مطياف الكتلة المحيطة للأنسجة البيولوجية بدقة مكانية عالية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الدراسات البيولوجية والصيدلانية.

مثل ما هي الجزيئات الموجودة في الخلايا المفردة الحية ، وكيف يتم توزيعها في الأنسجة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن المسبار الفردي هو جهاز متعدد الوظائف يمكن استخدامه لكل من تحليل الخلية المفردة الحية وتجارب تصوير قياس الطيف الكتلي المحيط عالية الدقة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكنها تحليل الخلايا والأنسجة المفردة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى يكون فيها أخذ العينات المجهرية مرغوبا فيه ، مثل تحليل الصاري للمواد الكيميائية والمستعمرات الدقيقة الحية والأغشية الحيوية.

سيوضح الإجراء معي وي راو ، باحث ما بعد الدكتوراه من مختبري. ضع عضوا كامل من الفأر محل الاهتمام في وسط بئر بلاستيكي صغير. اغمر العضو في مركب تضمين الأنسجة حتى ارتفاع حوالي 10 مم.

ضع الأنسجة على الفور في النيتروجين السائل للتجميد السريع. لتحضير قسم أنسجة الفأر ، خذ عضو الفأر المجمد وقم بإذابة الثلج إلى 15 درجة مئوية في ميكروتوم تبريد يتم التحكم في درجة حرارته. قم بتأمين الأنسجة على قاعدة فولاذية بها حوالي 500 ميكرولتر من مركب تضمين الأنسجة ، وضعها على حامل مقطع بالتبريد الميكروتوم بحيث يتم تقديم اتجاه التقسيم المطلوب إلى السكين.

قسم الأنسجة بسمك 12 ميكرون. بعد ذلك ، ضع شرائح الأنسجة المقطعة على شرائح مجهر البولي كربونات واتركها لتجف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. احصل على عينة خلية ، مثل 1 مليلتر من HeLa Cell Suspension ، وأضفها إلى 9 مل من وسط زراعة الخلايا الكامل في صفيحة زراعة خلية قياسية مقاس 10 سم.

حافظ على الخلايا في الثقافة عند 37 درجة مئوية ، مع 5٪ CO2 لمدة يومين إلى ثلاثة أيام ، حتى يتم تغطية سطح النمو بنسبة 70-80٪ على لوحة زراعة الخلية. قم بإجراء مرور الخلية في لوحة زراعة الخلية. للقيام بذلك ، قم بشفط وسط النمو واشطف الخلايا ب 5 مل من محلول ملحي مخزن 1x من الفوسفات.

قم بإزالة PBS باستخدام طرف شفط معقم واحتضان الخلايا ب 2.5 مل من التربسين لمدة 5 دقائق تقريبا عند 37 درجة مئوية لفصل الخلايا عن لوحة الثقافة. أوقف نشاط التربسين عن طريق إضافة 7.5 مل من وسط زراعة الخلايا الكامل ثم أعد تعليق الخلايا بشكل موحد. لتحضير عينات الخلية لقياس الطيف الكتلي أحادي الخلية ، أو تجربة SCMS ، ضع أولا شرائح الغطاء الصغير الفردية في آبار صفيحة مكونة من 12 بئرا.

ثم أضف 1.8 مل من وسط زراعة الخلايا و 0.2 مل من تعليق الخلية في البئر. امزج الخلايا برفق مع تحريك خفيف للوحة قبل احتضانها في بيئة 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية ، لمدة 24 ساعة تقريبا. لإجراء العلاج الدوائي للخلايا المستنبتة ، أضف محلول مركب دوائي إلى لوحة زراعة الخلايا المكونة من 12 بئرا.

ضع أنبوب الكوارتز ثنائي التجويف في مجتذب ماصة ليزر دقيقة، واسحب إبرة كوارتز مزدوجة التجويف. كنقاط انطلاق ، اضبط الحرارة على 400 ، والفتيل على ثلاثة ، والسرعة على 80 ، والتأخير على 150 ، والسحب على 250. قم بقص طرف السحب بحيث يكون هناك ما يقرب من 5 مم من الشعيرات الدموية الكوارتز ثنائية التجويف غير المسحوبة في الطرف الآخر.

قطع قسم 80 مم من الشعيرات الدموية المصنوعة من السيليكا المنصهرة كشعرية توفر المذيبات. ثم أدخل الشعيرات الدموية في تجويف واحد في الطرف المسطح لإبرة الكوارتز ذات التجويف المزدوج. باستخدام اللهب لسحب شعرية السيليكا المنصهرة كباعث nanoESI ، قم بقصه إلى 7-10 مم وإدخاله في التجويف الآخر في الطرف المسطح لإبرة الكوارتز ثنائية التجويف.

ضع كمية قليلة من راتنج المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية على الطرف المسطح لإبرة الكوارتز ثنائية التجويف. قم بترسيخ الراتنج باستخدام مصباح LED للأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 ثانية تقريبا ، لتأمين الشعيرات الدموية التي توفر المذيبات وباعث nanoESI. بعد ذلك ، قم بقص شريحة زجاجية مجهرية قياسية إلى نصفين بالطول.

بعد ذلك ، ضع المسبار الفردي على أحد طرفي الشريحة الزجاجية ، بحيث يتم توجيه باعث nanoESI للخارج. ضع الإيبوكسي العادي على جسم المسبار الفردي بحيث يصبح مثبتا على الشريحة الزجاجية قبل تركه طوال الليل للتصلب. يشتمل هذا النظام على شفة واجهة مصدر أيون مخصصة لمطياف الكتلة ، ولوحة بصرية من الألومنيوم متصلة بمجهر رقمي USB ، ومرحلة ترجمة XYZ يدوية مصغرة ، ونظام مرحلة الترجمة XYZ الآلي.

قم بتعديل شفة واجهة مصدر الأيونات لمطياف الكتلة وقم بتصنيع حامل المجهر المجسم الرقمي كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتوصيل المجهر المجسم الرقمي المعدل ، والمجهر الرقمي USB ، ومرحلة الترجمة اليدوية المصغرة XYZ مع حامل مشبك مرن ، ونظام مرحلة الترجمة XYZ الآلي باللوحة البصرية المصنوعة من الألومنيوم. استخدم حامل المشبك المرن لإصلاح الشريحة الزجاجية المرفقة بمسبار واحد.

بعد ذلك ، قم بتوصيل إعداد المسبار الفردي بمقياس طيف الكتلة. اضبط حامل المشبك المرن ، ومرحلة XYZ المصغرة ، لوضع باعث المسبار الفردي أمام مدخل مطياف الكتلة. قم بإذابة قسم العينة في درجة حرارة الغرفة ، وضعه على نظام مرحلة الترجمة XYZ الآلي أسفل المسبار الفردي.

اضبط موضع العينة عن طريق تغيير الإحداثيات في برنامج التحكم. استخدم حقنة لضخ مذيب أخذ العينات بمعدل مناسب. وبعد ذلك ، قم بتطبيق جهد التأين.

اضبط ارتفاع المسبار الفردي بحيث يستقر فوق سطح العينة مباشرة ، وقادر على إجراء استخراج سطحي للمستقلبات. ارفع المرحلة Z بعناية ، ثم استخدم المجهر الرقمي USB لمراقبة تغير المسافة بين طرف المسبار الفردي وسطح الأنسجة. قم بتعيين معلمات التنقيط عبر قسم الاهتمام داخل العينة.

بالنسبة لأقسام الكلى المعروضة هنا، استخدم سرعة تنقيط تبلغ 10 ميكرومتر في الثانية ومسافة 20 ميكرومتر بين الخطوط. قم بتعيين معلمات التنقيط عبر قسم الاهتمام داخل العينة. بالنسبة لأقسام الكلى المعروضة هنا، استخدم سرعة نقطية تبلغ 10.0 ميكرومتر في الثانية، ومسافة 20 ميكرومتر بين الخطوط.

إعداد طريقة للاكتساب الآلي لأطياف MS من مطياف الكتلة. للحصول على MSI عالي الدقة للكتلة على عينة كلية الفأر ، استخدم دقة كتلة تبلغ 60 ، 000 ، ووضع إيجابي 5 كيلو فولت ، ومسح مجهري واحد ، ووقت حقن أقصى 150 مللي ثانية ، وتحكم تلقائي في الكسب. ابدأ الحصول على بيانات MSI ، ثم قم بإنشاء صور MS من ملفات MS الأولية كما هو موضح في بروتوكول النص.

قم بإعداد نظام المسبار الفردي وفقا لتعليمات MSI واضبط معدل تدفق المذيبات. اغسل الخلايا المستنبتة المرفقة على الشرائح الزجاجية ذات الغلاف الدقيق باستخدام PBS لإزالة الوسائط الثقافية ومكونات الأدوية خارج الخلية. ثم ضع الشريحة الزجاجية المحتوية على الخلية على نظام مرحلة الترجمة XYZ الآلي للتجربة.

ركز المجهر المجسم الرقمي فوق العينة ، على طرف المسبار الفردي لمراقبة اختراق الخلية أثناء التحليل. استخدم المجهر الرقمي USB على جانب المسبار الفردي لمراقبة ظروف عمل باعث nanoESI على المسبار الفردي. استخدم برنامج التحكم في المرحلة XYZ الآلي والمجهر المجسم الرقمي لتحديد موقع الخلية ذات الأهمية ووضع طرف المسبار الفردي بدقة فوق العينة.

ابدأ الحصول على بيانات MS قبل إدخال طرف المسبار الفردي في الخلية. قم بخفض اللوحة المحتوية على الخلية لسحب طرف المسبار الفردي خارج الخلية. أخيرا ، اترك المذيب يتدفق لمدة ثلاث دقائق تقريبا ، لشطف المسبار الفردي تماما.

تم إجراء تصوير قياس الطيف الكتلي المحيط لأقسام كلى الفئران ، ويمكن اكتشاف عدد كبير من الجزيئات الموجودة على سطح الأنسجة. تم رسم التوزيع المكاني والوفرة النسبية للجزيئات المتعددة على سطح الأنسجة. تم تحقيق دقة مكانية تبلغ 8.5 ميكرون من خلال مراقبة التحولات الحادة للسمات الموجودة في بيانات قياس الطيف الكتلي.

تصنيع المسبار الفردي بطرف حاد وقنوات مفتوحة أمرا بالغ الأهمية لتحليل الخلية الواحدة. هناك حاجة إلى المجاهر لتحديد موقع الخلايا المستهدفة ومراقبة عملية اختراق الخلية. يوفر تغيير الإشارة من أطياف الكتلة أيضا معلومات إضافية لتأكيد اختراق الخلية.

تم اكتشاف عدد كبير من الجزيئات من خلايا مفردة حية. عند استخدامها لدراسات الأدوية المضادة للسرطان ، تستخدم تجارب الخلايا الضابطة لإظهار الفرق في العلاج بالأدوية المضادة للسرطان. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع المسبار الفردي ، وكيف يتم استخدام هذا الجهاز لتحليل قياس الطيف الكتلي لتصوير مطياف الكتلة أحادية الخلية والمحيطة للأنسجة البيولوجية.

بشكل عام ، قد يعاني الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن التعليمات التفصيلية ضرورية لتصنيع جهاز المسبار الفردي ، وإعداد النظام بأكمله ، وتشغيل الأدوات. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تحليل الخلية المفردة بشكل مستمر للعديد من الخلايا. ويستغرق كل تحليل أقل من ثلاث دقائق.

قد يستغرق الانتهاء من تجربة تصوير التصلب العصبي المتعدد المحيط بضع ساعات ، اعتمادا على حجم العينة والدقة المكانية ومطياف الكتلة المستخدم. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تصنيع مسبار واحد عالي الجودة هو الخطوة الأساسية. بالإضافة إلى ذلك ، يعد ضبط الأداة وتشغيلها أمرا بالغ الأهمية لإجراء تجربة بنجاح.

يمكن تطوير طرق أخرى باتباع إجراءات مماثلة لتلك المعروضة هنا. على سبيل المثال ، يمكن إضافة الكواشف إلى مذيب العينة ويمكن إجراء تحليل خلية واحدة تفاعلي ويمكن إجراء MSI المحيط لتحسين اكتشاف الجزيئات من العينات. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في كل من تحليل الخلية المفردة ودراسات التصوير اللطيفي الكتلي في ظل الظروف المحيطة.

يمكن استخدام هذه التقنية في أبحاث بيولوجيا الخلية ودراسات علم الأدوية والاختبارات السريرية. لا تنس أن العمل مع الشعيرات الدموية الكوارتز الحادة والإيبوكسي المعالج بالأشعة فوق البنفسجية يمكن أن يكون خطيرا ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ونظارات السلامة للأشعة فوق البنفسجية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.