التصوير متحد البؤر قياس التقلبات الكالسيوم داخل الهيولى العضلية شبكية من مثقف خلايا العضلات الملساء عن طريق الحنق المستندة إلى

الهدف العام من تقنية التصوير هذه هو مراقبة التقلبات في مستويات الكالسيوم داخل تجويف الشبكة الساركوبلازمية (SR) استجابةً لعوامل تحفيز تحرير الكالسيوم، وتحديداً في خلايا العضلات الملساء الوعائية. يمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة في توضيح دورة الكالسيوم الخلوية بطريقة أكثر مباشرة. على سبيل المثال، من المهم جداً معرفة العلاقة بين نقل الكالسيوم في الشبكة الساركوبلازمية وإجهاد الشبكة الإندوبلازمية (ER stress).

تكمن ميزة هذه التقنية في قدرتنا على قياس الكالسيوم مباشرة داخل لمعة الشبكة الساركوبلازمية، بدلاً من الاضطرار إلى استنباطه من قياسات غير مباشرة للتغيرات في السيتوبلازم. ستقوم غابرييلا زيوميك، طالبة الدراسات العليا في مختبري، بشرح هذه التقنية. لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير تخفيف بنسبة 1 إلى 25 من خليط البروتين في وسط DMEM.

بعد ذلك، انقل 200 µL من خليط البروتين في وسط DMEM إلى كل طبق زجاجي القاع بقطر 35 mm لتغطية الدائرة الزجاجية الداخلية في القاع بالكامل. اترك الأطباق في درجة حرارة الغرفة داخل كابينة السلامة لمدة 30 دقيقة على الأقل. وفي هذه الأثناء، قم بتدفئة وسط DMEM مع 10% من NCS حتى 37 °C في حمام مائي.

بعد ذلك، قم بإزالة DMEM من قارورة الزرع باستخدام ماصة زجاجية. لاحقاً، اغسل قاع القارورة بمحلول PBS معقم ودافئ لإزالة بقايا DMEM المتبقية. ولفصل خلايا العضلات الملساء المزروعة عن قاع القارورة، اغسل القارورة بسرعة باستخدام 1 mL من التربسين ثم قم بإزالته.

بعد ذلك، أضف ميليلتر آخر من trypsin. قم بتحريك القارورة بشكل دائري لمدة تتراوح من 30 إلى 60 ثانية لضمان ملامسة الإنزيم لكامل قاع القارورة قبل إزالتها. وبمجرد فصل الخلايا باستخدام trypsin، أضف DMEM طازجاً يحتوي على 10% NCS إلى القارورة لإيقاف تفاعل trypsin.

انقل محلول الخلايا الناتج من القارورة إلى أنبوب مخروطي نظيف ومصنف سعة 50 milliliter. ثم أضف one milliliter من وسط DMEM الطازج بالإضافة إلى 10 % من NCS إلى كل طبق يتم تحضيره. بعد ذلك، اقلب الأنبوب الذي يحتوي على محلول الخلايا بلطف عدة مرات لتفكيك أي كتلة قد تكون قد تكونت.

انقل الحجم المطلوب من محلول الخلايا الممزوج بلطف باستخدام الماصة إلى كل طبق. بعد ذلك، قم بتدوير كل طبق جيدًا باتجاه عقارب الساعة أو عكس اتجاه عقارب الساعة لضمان توزيع الخلايا بالتساوي على الزجاج في القاع. ومن الضروري إضافة عدد كافٍ من الخلايا إلى الطبق لضمان وصولها إلى درجة عالية من التلاقي (confluency) خلال الـ 48 ساعة القادمة من أجل التصوير الفعال.

بعد إضافة الوسط ومحلول الخلايا إلى كل طبق، تُحضن الأطباق عند 37 °C مع 5% CO2 لمدة ساعة واحدة على الأقل للسماح للخلايا بالالتصاق بشكل صحيح بالقاع الزجاجي. يتم فحص الأطباق تحت المجهر على فترات زمنية مدتها 15 دقيقة حتى تلتصق الخلايا بوضوح. ثم يتم استخراج حصة من Adenovirus D1 SR من التخزين عند -80 °C ونقلها إلى كابينة السلامة البيولوجية في حمام ثلجي متنقل. بعد ذلك.

قم بنقل الجرعة المطلوبة من D one SR المبرد إلى كل طبق باستخدام الماصة، واحضن الخلايا المصابة عند 37 درجة مئوية طوال الليل. وفي اليوم التالي، قم بتجديد الوسط الغذائي للخلايا بإضافة 1 ml من DMEM الطازج مضافاً إليه 10% NCS. بعد ذلك، احضن الأطباق في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5% من ثاني أكسيد الكربون طوال الليل.

بعد الحضانة طوال الليل، قم بإزالة وسط المزرعة من الطبق. اغسل طبق المزرعة باستخدام 1 mL من منظم HEPES-PSS الفسيولوجي الدافئ ثلاث مرات. بعد ذلك، أضف 1 mL من منظم HEPES-PSS الدافئ الطازج مباشرة قبل التسجيل.

قم بإجراء التصوير الأولي باستخدام تطبيق FRET SE عن طريق فتح البرنامج المرتبط بالمجهر البؤري. وبمجرد فتح التطبيق، انقر فوق علامة تبويب الإعداد (setup) لضبط إعدادات التجربة المطلوبة. قم بتغيير إعدادات القنوات يدويًا بحيث يتم استثارة الخلايا بالتتابع عند 440 nanometers للمانح وFRET، وعند 513 nanometers للمستقبل.

بعد ذلك، اضبط أطوال موجات الانبعاث عند 488 nanometers للمانح و535 nanometers لـ FRET والمستقبل. تلي ذلك ضبط شدة الضوء عند 15% من النفاذية مع زمن تعرض للإثارة مدته 150 millisecond للخلايا وفواصل زمنية مدتها 10 second بين عمليات التعرض. بعد ذلك، قم بتثبيت الطبق على منصة المجهر.

استخدم الزر "live" للتحقق من دقة الصورة. قم بضبط الإعدادات بشكل أكبر للحصول على الدقة المطلوبة. من علامة تبويب الإعدادات (setup)، التقط صورة للعينة باستخدام زر "capture image".

بالانتقال الآن إلى علامة تبويب التقييم (evaluation)، اختر الطريقة المناسبة لحساب كفاءات FRET للتجارب التي يتم إجراؤها. يوصى باستخدام الطريقة الثالثة التي تعتمد على الحساب النسبي (ratiometric calculation) في التجارب التي تتضمن بروتينات Cameleons مثل مؤشر D one SR. بعد ذلك، انتقل إلى علامة تبويب الرسم البياني (graph) لمراقبة قيم الكثافة التي يتم تسجيلها في رسم بياني.

إذا رغبت في ذلك، قم برسم منطقة اهتمام (ROI) في عارض الصور لمراقبة متوسط الكثافة المقابل لهذه المنطقة من الاهتمام على الرسم البياني. ابدأ التسجيل لجمع البيانات لمدة ثلاث دقائق على الأقل لضمان الحصول على إشارة خط أساس مستقرة قبل إدخال العامل المراد دراسته. بعد ذلك، قم بإدخال عامل تحريك الكالسيوم كأداة لاستنزاف كالسيوم الشبكة الساركوبلازمية (SR) عن طريق تطبيقه مباشرة في الطبق بالقرب من منطقة الاهتمام التي يتم تسجيلها.

استمر في التسجيل للمدة المطلوبة بعد المعالجة. بعد ذلك، التقط الصور المتسلسلة لنسبة FRET باستخدام مجهر بؤري مقلوب عبر تطبيق FRET SE. في هذه الخطوة، ولتحضير أطباق استنبات خلايا العضلات الملساء في الشريان الأورطي للجرذ، اغسل طبق الاستنبات بـ 1 mL من منظم HEPES-PSS الفسيولوجي الدافئ ثلاث مرات.

بعد ذلك، اخلط الكاشف مع 1 mL من محلول HEPES-PSS الدافئ ثم ضعه على أطباق المزرعة. قم بتحضين خلايا العضلات الملساء مع الكاشف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. وبعد مرور ساعة، أزل الكاشف من طبق المزرعة واغسله بمقدار 1 mL من محلول HEPES-PSS الفسيولوجي الدافئ ثلاث مرات.

بعد ذلك، أضف 1 mL من محلول HEPES-PSS المنظم الدافئ والطازج مباشرة قبل التسجيل. التقط صوراً متسلسلة باستخدام المجهر البؤري العاكس (confocal inverted microscope). ثم، قم بإدخال عامل تحريك الكالسيوم كأداة لاستنفاد كالسيوم الشبكة الساركوبلازمية (SR calcium)، واستمر في التسجيل للمدة الزمنية المطلوبة بعد المعالجة.

تظهر هنا لقطات ممثلة لخلية عضلة ملساء تم نقل مؤشر D one SR إليها باستخدام مرشحات تمرير النطاق CFP و FRET و YFP. يوضح هذا الشكل لقطات ملونة كاذبة في الوقت الفعلي لخلايا العضلات الملساء في الأبهر لدى الجرذ المستزرعة والتي تم نقل D one SR إليها. أظهرت المعالجة بـ 2 µM من Thapsigargin انخفاضًا في شدة الإشارة، مما يشير إلى انخفاض ملحوظ في محتوى الكالسيوم في الشبكة الساركوبلازمية (SR) نتيجة لتحرر الكالسيوم الناجم عن Thapsigargin. ويوضح هذا الرسم البياني المنحنى الممثل لنسبة D one SR المعيارية في خلايا العضلات الملساء المستزرعة والمعالجة بـ 2 µM من Thapsigargin، مما أكد حدوث انخفاض ملحوظ في كالسيوم الشبكة الساركوبلازمية (SR).

فيما يلي لقطات تمثيلية لخلايا العضلات الملساء في الشريان الأورطي للجرذ المستزرعة، والمحملة بمؤشر الكالسيوم السيتوبلازمي والمعالجة بـ 2 micromolar من Thapsigargin. وكما هو موضح، يسبب Thapsigargin زيادة ملحوظة في شدة الإشارة داخل السيتوبلازم نتيجة لإطلاق الكالسيوم من الشبكة الساركوبلازمية (SR). ويوضح هذا الرسم البياني تتبعاً تمثيلياً لنسبة Fluo four AM الموحدة في خلايا العضلات الملساء المستزرعة والمعالجة بـ 2 micromolar من Thapsigargin. وتعتبر الزيادة الموضحة في إشارة الكالسيوم متناسبة مع كمية الكالسيوم المنطلقة من الشبكة الساركوبلازمية (SR). وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 48 ساعة تقريباً من البداية إلى النهاية إذا تم القيام بها بشكل صحيح.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم الحفاظ على الخلايا في الظروف الموصوفة لضمان سلامتها قبل عملية ترنسفكشن (transfection) بمؤشر الكالسيوم. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم واضح لكيفية تحضير الخلايا المستزرعة للسماح بقياس مستويات الكالسيوم في لومن الشبكة الساركوبلازمية (lumenal SR calcium) باستخدام مؤشر D one SR.