طريقة لاستهداف وعزل مجرى الهواء-التعصيب الخلايا العصبية الحسية في الفئران

الهدف العام من هذه التجربة هو وسم وعزل العصبونات العقدية في العصب المبهم التي تعصب المجاري التنفسية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال البيولوجيا العصبية الطرفية، مثل: ما هي الخصائص المحددة التي تمتلكها العصبونات التي تعصب المجاري التنفسية؟

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها توفر طريقة قوية وذات إنتاجية عالية لاستهداف وعزل مجموعات عصبونية محددة. بعد حصاد العقد الحسية، اسحب 500 µL من محلول تفكيك العقد من كل أنبوب، دون تحريك العقد. بعد ذلك، أضف 1 mL من PBS إلى كل عينة، وانتظر حتى تترسب العقد في قاع الأنابيب.

بعد ذلك، قم بإزالة PBS وإضافة 1 ml من محلول تفكيك العقد العصبية المدعم بإنزيم الهضم إلى العصبونات، ثم أضف 20 µL من Fast Blue إلى أنبوب الضبط الموجب. حضن الأنابيب عند 37 °C للمدة المناسبة بناءً على عمر إنزيم الهضم. قم برج وهز الأنابيب لفترة وجيزة كل 15 دقيقة، لضمان تغطية العقد العصبية بمحلول الهضم.

أثناء هضم الخلايا العصبية، أضف ببطء وحذر 400 µL من محلول بكثافة 12% تم تحضيره حديثاً فوق 400 µL من محلول بكثافة 28% في أنبوب سعة 1.5 mL واحد لكل عينة. يجب أن تظهر طبقتان متمايزتان، إحداهما أغمق من الأخرى. بعد ذلك، قم بوضع ملصقات على أنابيب تجميع سعة 1.5 mL لعملية الفرز، بحيث يتوفر أنبوب واحد إيجابي لصبغة Fast Blue وأنبوب واحد سلبي لصبغة Fast Blue لكل عينة فرز.

في نهاية فترة الهضم، تخلص من إنزيم الهضم واغسل العقد العصبية مرتين باستخدام 1 mL من PBS كما تم توضيحه للتو. بعد الغسلة الثانية، أضف 200 µL من محلول تفكيك العقد العصبية الطازج إلى كل أنبوب. بعد ذلك، وباستخدام ماصة 200 µL مضبوطة على حجم 100 µL، قم بسحب العقد العصبية ودفعها للأعلى والأسفل عدة مرات لتفكيك الخلايا إلى معلق خلوي مفرد، مع الحرص على تجنب تكون الفقاعات.

عندما لا تظهر أي قطع نسيجية سليمة، أمسك مصفاة خلايا بمسام 70 ميكرون بإحكام في إحدى اليدين، ثم انقل محلول الخلايا المفككة باستخدام الماصة إلى مركز المصفاة. بعد ذلك، اغسل أنبوب التفكيك باستخدام 100 ميكرولتر من محلول تفكيك العقد العصبية الطازج لجمع أي خلايا إضافية. قم بترشيح سائل الغسيل عبر المصفاة، واستخدم طرف مصاصة جديد لسحب أي محلول متبقٍ يحتوي على خلايا من الجانب السفلي للمصفاة، وإضافته إلى معلق الخلايا.

الآن، قم بإضافة 300 µL من الخلايا بعناية فوق تدرج الكثافة الذي تم تحضيره مسبقاً. ثم اجمع خلايا العقد العصبية عن طريق الطرد المركزي. وأثناء دوران الخلايا، أضف 300 µL من محلول التحلل (lysis buffer) المُحضّر حديثاً إلى أنبوب تجميع الخلايا الموجبة لصبغة Fast Blue، و600 µL من محلول التحلل إلى أنبوب تجميع الخلايا السالبة، وذلك لضمان عدم قيام سائل الغلاف الخاص بعملية الفرز بتخفيف محلول التحلل بشكل ملحوظ.

في نهاية عملية الطرد المركزي، قم بإزالة الـ 700 microliters العلوية من المحلول التي تحتوي على معظم حطام الخلايا بعناية. بعد ذلك، اخلط 700 microliters من محلول تفكيك العقد الجديدة مع الخلايا المتبقية. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي وتخلص من السائل الطافي بعناية.

ثم أعد تعليق الخلايا في 200 إلى 300 µL من محلول تفكيك العقد العصبية الخاص بالفرز باستخدام ماصة 1,000 µL مضبوطة على 200 µL. وضع الخلايا على الثلج حتى يحين موعد الفرز. بعد تنقية خلايا العقد العصبية بواسطة تقنية FACS، قم بمجانسة الخلايا العصبية في محلول التحلل لمدة دقيقة واحدة باستخدام جهاز Vortex.

بعد ذلك، اخلط الخلايا عدة مرات بحجم مساوٍ من 70% ethanol وانقل ما يصل إلى 700 microliters من العينة إلى عمود طرد مركزي (spin column). قم بطرد العمود مركزياً لمدة 15 ثانية عند 8,000 x g في جهاز طرد مركزي دقيق (microcentrifuge) وتخلص من السائل المترشح. عندما تمر العينة بأكملها عبر عمود الطرد المركزي، استخلص الـ RNA وفقاً لبروتوكولات تنقية RNA القياسية.

بعد ذلك، استخدم نظام الرحلان الكهربائي للموائع الدقيقة لاختبار جودة الـ RNA وفقاً لمواصفات الشركة المصنعة. تظهر هذه الرسوم البيانية ضوابط Fast Blue السلبية والإيجابية المستخدمة لضبط بوابات الفرز. يمكن بعد ذلك فرز خلايا العقدة المصبوغة بـ Fast Blue المفككة إلى مجموعات إيجابية وسلبية لـ Fast Blue.

تتراوح كفاءة الفرز لهذه الطريقة بين 73 إلى 85%، مع جمع ما يقارب 1,500 خلية أو أقل من الخلايا الموجبة لصبغة Fast Blue ونحو 60,000 خلية سالبة لصبغة Fast Blue في المتوسط. وكما لوحظ في هذه العينة الممثلة، يمكن استخدام قمم 18S و 28S التي تم الحصول عليها عن طريق الفصل الكهربائي للموائع الدقيقة لحساب رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RNA integrity number) لتحديد جودة الـ RNA المستخلص. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون أربع ساعات ونصف إذا نُفذت بشكل صحيح.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الانتقال عبر الخطوات بسرعة واستخدام محاليل مُحضرة حديثًا لاستخلاص الـ RNA. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل استزراع الخلايا العصبية للإجابة على أسئلة إضافية، مثل ما هي الخصائص الوظيفية الفريدة للعصبونات التي تغذي المجاري التنفسية؟ وبعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا العصبية الطرفية لاستكشاف الخصائص الفريدة لمجموعة محددة من العصبونات التي تغذي المجاري التنفسية في العقد العقدية للعصب المبهم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية وسم وفصل عصبونات محددة من العقد العصبية العقدية (nodose ganglia)، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتسلسل الحمض النووي الريبي (RNA sequencing)، أو زراعتها لإجراء دراسات وظيفية. لا تنسَ أن العمل باستخدام 2-Mercaptoethanol يمكن أن يكون خطيراً للغاية، وأنه يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات والعمل داخل غطاء كيميائي (chemical hood) عند استخدام هذا المركب.