طريقة لاستهداف وعزل مجرى الهواء-التعصيب الخلايا العصبية الحسية في الفئران

الهدف العام من هذه التجربة هو تسمية وعزل الخلايا العصبية العصبية المؤصلة للمجرى الهوائي في العصب المبهم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب المحيطي. مثل ، ما هي خصائص تحديد الخصائص التي تمتلكها الخلايا العصبية المؤصلة لمجرى الهواء؟

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر طريقة قوية وعالية الإنتاجية لاستهداف وعزل مجموعات عصبية معينة. بعد حصاد العقد الحسية ، استنشق 500 ميكرولتر من محلول تفكك العقد من كل أنبوب ، دون إزعاج العقدات. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من PBS إلى كل عينة ، وانتظر حتى تستقر العقد في قاع الأنابيب.

بعد ذلك ، قم بإزالة PBS وأضف ملليلترا واحدا من محلول تفكك العقد المكمل بإنزيم الهضم إلى الخلايا العصبية ، متبوعا بإضافة 20 ميكرولترا من Fast Blue إلى أنبوب التحكم الإيجابي. احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية للوقت المناسب بناء على عمر إنزيم الهضم. هز الأنابيب ونقرها لفترة وجيزة كل 15 دقيقة ، لضمان تغطية العقد بمحلول الهضم.

أثناء هضم الخلايا العصبية ، أضف ببطء وحذر 400 ميكرولتر من محلول الكثافة 12٪ المحضر حديثا أكثر من 400 ميكرولتر من محلول كثافة 28٪ في أنبوب واحد سعة 1.5 مليلتر لكل عينة. يجب أن تكون طبقتان متميزتان مرئيتين ، إحداهما أغمق من الأخرى. بعد ذلك ، قم بتسمية أنابيب تجميع 1.5 ملليلتر للفرز ، بما في ذلك أنبوب سريع أزرق موجب وأنبوب سلبي أزرق سريع لكل عينة فرز.

في نهاية فترة الهضم ، تخلص من إنزيم الهضم واغسل العقد مرتين باستخدام مليلتر واحد من PBS كما هو موضح للتو. بعد الغسيل الثاني ، أضف 200 ميكرولتر من محلول تفكك العقد الطازج إلى كل أنبوب. بعد ذلك، باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر مضبوطة على حجم 100 ميكرولتر، قم بتحريك العقد لأعلى ولأسفل عدة مرات لفصل الخلايا إلى معلق خلية واحدة، مع الحرص على تجنب الفقاعات.

عندما لا تظهر أي قطع نسيجية سليمة ، أمسك مصفاة خلية 70 ميكرون بإحكام بيد واحدة ، قم بإدخال محلول الخلية المنفصلة في وسط المصفاة. ثم اغسل أنبوب التفكك ب 100 ميكرولتر من محلول تفكك العقد الطازج لجمع أي خلايا إضافية. قم بلف الغسيل من خلال المصفاة واستخدم طرف ماصة جديد لشفط أي خلية متبقية تحتوي على محلول على الجانب السفلي من المصفاة ، وإضافته إلى تعليق الخلية.

الآن ضع بعناية كل 300 ميكرولتر من الخلايا فوق تدرج الكثافة المعد مسبقا. وجمع خلايا العقد عن طريق الطرد المركزي. أثناء دوران الخلايا ، أضف 300 ميكرولتر من مخزن التحلل المؤقت المحضر حديثا إلى أنبوب التجميع الإيجابي Fast Blue و 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل إلى أنبوب التجميع السالب للتأكد من أن سائل غمد الفرز لا يخفف بشكل كبير من مخزن التحلل.

في نهاية الطرد المركزي ، قم بإزالة أعلى 700 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على غالبية بقايا الخلية بعناية. ثم اخلطي 700 ميكرولتر من محلول تفكك العقد الطازج مع الخلايا المتبقية. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي وتخلص بعناية من المادة الطافية.

ثم أعد تعليق الخلايا في 200 إلى 300 ميكرولتر من محلول تفكك العقد الفرز باستخدام ماصة سعة 1,000 ميكرولتر مضبوطة على 200 ميكرولتر. ووضع الخلايا على الجليد حتى تصبح جاهزة للفرز. بعد تنقية خلايا العقد بواسطة FACS ، قم بتجانس الخلايا العصبية في محلول التحلل لمدة دقيقة واحدة مع الدوامة.

بعد ذلك ، قم بخلط الخلايا عدة مرات بحجم واحد من 70٪ من الإيثانول وانقل ما يصل إلى 700 ميكرولتر من العينة إلى عمود دوران. الطرد المركزي العمود لمدة 15 ثانية عند 8,000 × جم في جهاز طرد مركزي دقيق وتخلص من التدفق من خلاله. عندما يتم تمرير العينة بأكملها عبر عمود الدوران ، استخرج الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكولات تنقية الحمض النووي الريبي القياسية.

ثم استخدم نظام الرحلان الكهربائي للموائع الدقيقة لاختبار جودة الحمض النووي الريبي وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. في هذه الرسوم البيانية ، يتم عرض عناصر التحكم السلبية والإيجابية في Fast Blue المستخدمة لتعيين بوابات الفرز. يمكن بعد ذلك فرز خلايا Fast Blue Labeled Nodose المنفصلة إلى مجموعات سكانية إيجابية للأزرق السريع وأزرق سريع سلبية.

تتراوح كفاءة الفرز لهذه الطريقة من 73 إلى 85٪ مع ما يقرب من 1،500 أو أقل من Fast Blue الإيجابي وما يقرب من 60،000 خلية سلبية زرقاء سريعة تم جمعها في المتوسط. كما لوحظ في هذه العينة التمثيلية ، يمكن بعد ذلك استخدام القمم 18S و 28S التي تم تحقيقها عن طريق الرحلان الكهربائي للموائع الدقيقة لحساب رقم سلامة الحمض النووي الريبي لتحديد جودة الحمض النووي الريبي المستخرج. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في أربع ساعات ونصف إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التحرك عبر الخطوات بسرعة واستخدام المحاليل المعدة حديثا لاستخراج الحمض النووي الريبي. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل زراعة الخلايا العصبية للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل ما هي الخصائص الوظيفية الفريدة للخلايا العصبية المؤصلة لمجرى الهواء؟ بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب المحيطي لاستكشاف الخصائص الفريدة لمجموعة معينة من الخلايا العصبية التي تعصيب مجرى الهواء في العقد العبقية للعصب المبهم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسمية وفصل الخلايا العصبية المحددة للعقد العقدية التي يمكن استخدامها بعد ذلك لتسلسل الحمض النووي الريبي ، أو طلاءها للدراسات الوظيفية. لا تنس أن العمل مع 2-Mercaptoethanol يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، وأن الاحتياطات مثل ارتداء القفازات والعمل في غطاء كيميائي يجب دائما اتخاذ الاحتياطات عند استخدام هذا المركب.