التفريق بين الرجفان العضلية من الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام BMP خصم Grem2

الهدف العام من بروتوكول التمايز هذا هو توليد مجموعات متجانسة من خلايا عضلة القلب الأذينية في الثقافة. لذلك يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في دراسة نمو القلب وأمراض القلب مثل عدم انتظام ضربات القلب الأذيني. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تنتج ثقافات متجانسة من خلايا عضلة القلب الأذينية في المختبر وأنه يمكن القيام بذلك بأقل قدر من التدريب.

حتى أربعة أيام قبل إعداد الخلايا الجذعية الجنينية للفأر ، أو مزارع mESC ، قم بترميز أطباق الأنسجة التي يبلغ طولها 10 سم مع 5 ملليلتر من محلول الجيلاتين 0.2٪ لكل منها ، في ستة ألواح آبار مع 1 مليلتر من الجيلاتين لكل بئر في غطاء مزرعة الأنسجة المعقم. في يوم الثقافة ، قم بإزالة محلول الجيلاتين الإضافي ، وأضف 10 مل من المتوسط إلى أحد الأطباق المغطاة بالجيلاتين التي يبلغ طولها 10 سم. بعد ذلك ، استخدم cryotongs لتحريك قارورة من 1 في 10 إلى 6 mESC برفق في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية حتى تبقى بلورة جليدية صغيرة فقط في وسط القارورة.

جفف القارورة بمنديل يمكن التخلص منه وخالي من النسالة وتعقيمها بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم ضع القارورة في غطاء مزرعة الأنسجة واستخدم ماصة P1000 لإضافة ESC إلى الطبق. ضع الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، وحرك اللوحة برفق من الأمام إلى الخلف ومن جانب إلى آخر لتوزيع الخلايا بالتساوي.

في نهاية الحضانة ، استخدم مجهر المجال الساطع لتأكيد ارتباط الخلية. سيتم ملاحظة بعض الحطام والخلايا الميتة. استبدل الوسط ب 10 ملليلتر من وسط mESC الطازج ، وأعد الخلايا إلى الحاضنة.

عندما تكون المزرعة 60 إلى 70٪ ملتصقة ، اشطف الطبق ب 5 مل من DPBS المعقم بدون المغنيسيوم والكالسيوم ، واحتضن الخلايا في 2 مل من التربسين EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. أثناء احتضان الخلايا ، استنشق محلول الجيلاتين الزائد من طبق جديد يبلغ طوله 10 سم لكل مزرعة عابرة ، وأضف 10 مل من الوسط إلى كل طبق. ثم اجمع الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي في أنبوب سعة 15 مليلتر ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من وسط mESC.

اعتمادا على نسبة الانقسام المطلوبة ، أضف 0.5 إلى 1 مليلتر من تعليق الخلية إلى كل طبق 10 سم وأعد الخلايا إلى الحاضنة ، ووزع الخلايا برفق في كل طبق كما هو موضح للتو. عندما تكون الخلايا المنارة ملتقية بنسبة 70٪ ، افصلها باستخدام التربسين EDTA كما هو موضح للتو ، ثم أعد تعليق الخلية المفردة في 5 ملليلتر من الجسم الجنيني أو وسط EB. عد mESC ثم قم بتخفيفها في الحجم المناسب من وسط EB إلى تركيز نهائي 2.5 في 10 إلى الخلايا الثالثة لكل مليلتر.

بعد ذلك ، أضف 2 مل من PBS إلى قاع طبق بتري بكتيري معقم يبلغ طوله 10 سم لكل ثقافة قطرة معلقة ، وانقل تعليق EB إلى حوض محلول معقم. الآن ، قم بإزالة الغطاء من أحد الأطباق المعدة واستخدم ماصة متعددة القنوات ، مزودة بستة أطراف ، لإيداع 60 قطرة سعة 20 ميكرولتر من تعليق EB بعناية على السطح الداخلي. ضع الغطاء برفق مرة أخرى على الطبق ، مع الحرص على عدم إخراج القطرات المعلقة ووضع الأطباق في حاضنة زراعة الخلايا لمدة يومين.

لغسل EB، قم بإزالة الغطاء بعناية من ثقافة القطرات المعلقة، وقم بإمالته بزاوية 45 درجة. بعد ذلك، باستخدام ماصة مصلية سعة 5 ملليلتر تحتوي على وسط EB بدرجة حرارة الغرفة، اغسل الماصة المصلية برفق في حوض سباحة في أسفل الغطاء. افحص الغطاء بعناية بحثا عن EB الملتصقة بالسطح ، ثم انقل EB إلى طبق بتري غير مطلي يبلغ طوله 6 سم.

أعد EB إلى حاضنة زراعة الأنسجة لمدة يومين آخرين ، وفحص الألواح يوميا بحثا عن تجميع EB وإرفاقه. قبل طلاء EB ، استبدل محلول طلاء الجيلاتين الزائد في كل بئر من اللوحة المكونة من ستة آبار محضرة ، ب 2 مل من وسط معالجة Grem2 المحضر حديثا بدرجة حرارة الغرفة. ثم استخدم ماصة P1000 مضبوطة على 100 ميكرولتر لنقل 30 ماصة إلى كل بئر، ثم أعد اللوحة إلى الحاضنة طوال الليل، مع تشتيت الخلايا بالتساوي بحركة لطيفة كما هو موضح

بعد أن يتم ربط EB بقاع الآبار ، استبدل وسيط Grem2 كل يومين حتى اليوم 10. بعد ذلك ، قم بتغذية الخلايا بوسط EB طازج كل يومين للحفاظ على مزرعة خلوية صحية. قبل زراعة القطرة المعلقة ، يجب أن تكون الخلايا الجذعية متعددة القدرات مضغوطة وخالية من التمايز التلقائي.

إذا لوحظ تمايز تلقائي ، فلا ينبغي استخدام الخلايا في مزارع القطرات المعلقة. يتم تشكيل الجودة EB بشكل أفضل بشكل عام داخل قطرات معلقة متباعدة بشكل متساو ومستديرة جيدا. من خلال اليوم الثاني للتمايز ، يجب أن تكون EB مرئية للعين المجردة ، كترتيبات كروية لتفريق الخلايا الجذعية عند أطراف القطرات المعلقة.

في اليوم الرابع ، يجب أن تكون EB جيدة التكوين عائمة بحرية ومتجانسة في الحجم والشكل. بمجرد طلاءها ، سوف تتسطح EB عندما تهاجر الخلايا من EB إلى سطح لوحة زراعة الأنسجة ، كما لوحظ هنا في يومي التمايز الثامن و 10. في آبار التحكم غير المعالجة ، لوحظت بقع صغيرة تتقلص ببطء في وقت مبكر من اليوم السادس وفي وقت متأخر من اليوم التاسع.

بينما في الآبار المعالجة ب Grem2 ، تكون البقع الكبيرة ذات معدل الانكماش السريع نسبيا شائعة. عادة ما يكشف تحليل RT-QPCR للتعبير الجيني في الخلايا المتمايزة عن مستويات عالية من الجينات الهيكلية والتنظيمية للقلب في الثقافات المعالجة ب Grem2. إذا تم استخدام خط الخلايا النووية alpha-MHC DsRed ، لوحظ زيادة إنتاجية خلايا عضلة القلب كعدد أكبر من النوى المسماة DsRed في الآبار المعالجة ب Grem2.

يتحيز علاج Grem2 أيضا التمايز نحو نمط ظاهري يشبه الأذين ، كما أكدته RT-QPCR وقياسات مشبك التصحيح للمدة المحتملة للعمل الخلوي. بمجرد إتقانها ، يمكن معالجة الخلايا الجذعية المتمايزة باستخدام Grem2 في أقل من 60 دقيقة وعادة ما يتم ملاحظة الخلايا المزخرفة في وقت مبكر من اليوم السابع. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إضافة Grem2 باستمرار في اليوم الرابع بعد ذروة التعبير عن علامات المعدة مثل العضدية.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الفيزيولوجيا الكهربية و QPCR لفهم الخصائص الوظيفية والجزيئية للخلايا التي تم إنشاؤها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد خلايا عضلة القلب الأذينية من ESC للفأر ، باستخدام Grem2.