باستخدام تقنية الترقق لتنفيذ متحد البؤر المجهري للالصلبة الإنسان

الهدف العام من هذه المنهجية هو إجراء الفحص المجهري متحد البؤر للصلبة البشرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال طب العيون. مثل توزيع الخلايا المناعية وحالة الأوعية الدموية في الأصحاء ، والحالات المرضية في الصلبة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتصوير متحد البؤر للنسيج الضام الكثيف. سيوضح الإجراء ستيفان كريمرز ، طالب دراسات عليا من مختبرنا. للبدء ، قم بإعداد 96 في المائة من الإيثانول و PBS في أنابيب فردية.

ثم قم بإعداد 100 لتر ميكرو لكل عينة من الأجسام المضادة الأولية في التخفيف الموصى به ل PBS الذي يحتوي على اثنين بالمائة من BSA ، واحتفظ بجميع المحاليل على الجليد. رتب أدوات نظيفة ، بما في ذلك ملقط كوليبري واحد أو اثنين ، ومقص تشريح دقيق مستقيم ، ومقص منحني ، ومشرط رقم 10 ، أو ريشة صغيرة لمشرط العين ، وأربع إبر قياس 26 ، ومسحة. لف ورق الألمنيوم حول لوح البوليسترين ، أو قم بإعداد صفيحة من الفلين لتثبيت الأنسجة.

بعد إنتاج لمبة مفتوحة من الأمام وفقا لبروتوكول النص ، ضع الصلبة على مسحة بحيث يكون الجزء المفتوح متجها لأعلى. ثم استخدم ملقط القولوني لإزالة شبكية العين ، وطبقات العنبية المصطبغة من الصلبة الداخلية حتى تصبح الصلبة خالية من هذه الطبقات. بعد ذلك ، استخدم المقص المنحني إذا لزم الأمر لإزالة شبكية العين والعنبية من الحليمة.

ثم قم بإزالة الملتحمة المتبقية ، والعضلات البيضاوية خارج البيض ، وكبسولة اللسان من الصلبة السطحية. الآن باستخدام ملقط الكوليبري لتثبيت الأنسجة برفق ، باستخدام مقص مستقيم يقطع ما يقرب من عينتين صلبيتين بحجم سنتيمتر مربع من مواقع مختلفة على الأنسجة ، وتجنب الإمساك المتكرر بالملقط مما يجعل المنطقة غير مناسبة للفحص المجهري متحد البؤر. ضع العينات في أنابيب سعة 1.5 ملليلتر ، وأضف 1.5 مل من الإيثانول بنسبة 96 في المائة ، واحتضنها لمدة 15 دقيقة لإصلاح الأنسجة.

ثم بعد إزالة الإيثانول ، استخدم 1.5 مل من PBS لغسل العينات ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها أثناء الرج. بعد ذلك ، انقل العينات إلى 1.5 مل من PBS مع خمسة بالمائة BSA ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين مما يؤدي إلى تورم العينات ، للمساعدة في التصفيح ومنع الارتباط غير المحدد. عندما تنتفخ العينات ، تحت المجهر المجهري المجهر المجسم ، استخدم 26 إبرة قياس تم ثنيها عند الحواف لتثبيت عينات الصلبة الخلفية على غشاء البوليسترين الملفوف بورق الألمنيوم ، أو لوحة الفلين.

ثم لتصفيح عينات السماكة الكاملة ، استخدم ملقط الكوليبري لتثبيت الحافة الأمامية للأنسجة الصلبة أفقيا. باستخدام مشرط رقم 10 ، قم بقص طبقة رقيقة قدر الإمكان من الصلبة السطحية بعناية ، من الطبقة الأساسية. لمنع جفاف الماصة ، ضع 50 لترا صغيرا من PBS على الطبقات.

ثم بعد قطع الطبقات ، ضعها في 100 ميكرو لتر من PBS في لوح بئر 96 ، واستخدم علامة مقاومة للماء لتسمية كل من الاتجاه والطبقة. استمر في عزل الطبقات ونقلها إلى لوحة البئر 96 حتى يتم تصفيح الأنسجة بالكامل. لإجراء الكيمياء المناعية ، قم بإزالة الوسط من لوحة البئر 96 عن طريق تثبيت الماصة على جدار كل بئر وشفط السائل.

ثم أضف 100 ميكرو لتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة من واحد إلى 100 في PBS مع اثنين بالمائة من BSA إلى الآبار المناسبة ، واحتضانها عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، استخدم 200 إلى 300 ميكرو لتر من PBS لغسل العينات على شاكر ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها. إذا لزم الأمر ، استخدم جسما مضادا أساسيا آخر واحتضنه مرة أخرى طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

ثم أضف 100 ميكرو لتر من الأجسام المضادة الثانوية المقابلة ، وتخفيفها من واحد إلى 300 في PBS مع مصل الماعز بنسبة اثنين بالمائة ، واحتضانها في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة إلى ساعتين. بعد الحضانة ، استخدم 200 إلى 300 ميكرو لتر من PBS لشطف العينات مرة أخرى على الخلاط ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها. ثم أضف 100 ميكرو لتر من مخفف واحد إلى 2000 من DAPI إلى كل بئر واحتضنه في الظلام في درجة حرارة الغرفة.

قبل استخدام 200 إلى 300 ميكرو لتر من PBS لغسل العينات مرتين. انقل العينات إلى شرائح المجهر تحت المجهر المجهري المجسم للتأكد من أن العينة ملقاة بشكل مسطح على الشريحة ، وأضف قطرة إلى قطرتين من وسط تركيب الفلورسنت. ثم ضع زلة غطاء في الأعلى واستخدم طلاء أظافر شفاف لإغلاق الحواف.

يحفظ في الظلام عند أربع درجات مئوية لاستخدامه لاحقا أو يفحصه مباشرة عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. للتحقق من سمك العينات ، خذ مداخن z حيث يختلف السماكة استوائية وخلفيا اعتمادا على موقع الصلبة. تظهر هذه الصور الشبكة المتنوعة لضفيرة الأوعية الدموية في الصلبة البشرية الرقائقية المشتقة من التصلب الأمامي والخلفي.

الأوعية الدموية إيجابية ل CD31 كما هو موضح باللون الأخضر. في هذا الشكل ، يتم توضيح الخلايا المناعية الإيجابية LYVE1 للصلبة وعلاقتها بالأوعية الدموية الإيجابية CD31. تم أخذ سلسلة z-stack بتكبير 10x لفحص العلاقات ثلاثية الأبعاد للأوعية الدموية والخلايا المناعية.

كما هو موضح هنا ، يمكن أيضا تحليل العضلات خارج العين المحاطة داخل الصلبة لوجود الأوعية الدموية أو الخلايا المناعية ، باستخدام العلامات CD31 و LYVE1 على التوالي. بمجرد إتقان تقنية الترقق ، يمكن إجراؤها في أقل من ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر منع الأنسجة من الجفاف.

لا تنس أن العمل مع الأنسجة البشرية يمكن أن يكون معديا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل التشخيص الميكروبيولوجي والفيروسي مسبقا.