استهداف بيوفيلم أسوشيتد

يتمثل الهدف العام من هذا الإجراء في تنمية الأغشية الحيوية البكتيرية بسهولة وبطريقة قابلة للتكرار في تنسيق لوحة ذات 96 بئراً على أوتاد مثبتة بالغطاء، وذلك لإجراء اختبارات الحساسية للمضادات الحيوية باستخدام صبغة حيوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال اكتشاف وتطوير المضادات الحيوية من خلال استكشاف الأنشطة على الخلايا المرتبطة بالغشاء الحيوي، والتي غالباً ما تكون أكثر تمثيلاً لحالات العدوى داخل الجسم الحي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في القدرة على اختبار الأغشية الحيوية المتكونة مسبقاً بسهولة في مقايسة ثلاثية الأجزاء في الوسط، وتحديد التثبيط باستخدام صبغة حيوية شائعة.

للبدء، قم باستزراع كائن منتج للغشاء الحيوي في وسط غني بالمغذيات. قم بتلقيح سلالة Staphylococcus aureus Newman من ساق جليسرول في 10 milliliters من وسط Muller-Hinton. قم بإجراء جميع الأعمال التي تتضمن التعامل مع S.aureus باستخدام القفازات، وداخل كابينة السلامة البيولوجية.

يتم التحضين لمدة 16 ساعة عند 37 °C على هزاز دوار. أضف حجم المزرعة المحسوب إلى أنبوب طرد مركزي، ثم قم بترسيب الخلايا عن طريق الدوران لمدة دقيقة واحدة عند 10,000 Gs. ولتحضير لقاح الغشاء الحيوي، يتم سحب وسط النمو المستنفد وإعادة تعليق كتلة الخلايا المترسبة في 20 milliliters من CRPMI. وباستخدام ماصة متعددة القنوات سعة 200 microliter، أضف 125 microliters من اللقاح من خزان سعة 25 milliliter إلى كل بئر من الصفوف من A إلى G في اللوحة السفلية.

املأ كل بئر في الصف H بـ 125 µL من وسط CRPMI المعقم ليكون بمثابة ضابط للتعقيم. أمسك غطاء المسامير وثبته فوق قاع الطبق بحيث تكون المسامير متجهة للأسفل. قم بمحاذاة كل مسمار بدقة مع البئر المقابل له.

تجنب التلامس المادي بين الطبق والمسامير. بمجرد المحاذاة، خفّض الغطاء بعناية إلى الأسفل. قم بإحكام غلق الغطاء على الطبق باستخدام فيلم البارافين لمنع التبخر، ثم وضعه في كيس بلاستيكي قابل للإغلاق، وأغلقه بإحكام.

حافظ على أقل حجم ممكن من الهواء داخل الكيس لتقليل التبخر. قم بتحضين الطبق دون رج عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة، في حاضنة تحتوي على 5% Carbon Dioxide. في يوم اختبار الغشاء الحيوي (biofilm challenge)، أحضر طبقاً جديداً مكوناً من 96 بئراً وأضف 100 microliters من CRPMI، بعد موازنته إلى درجة حرارة الغرفة، إلى كل بئر في الصفوف من B إلى H. قم بتخفيف ما يصل إلى أربعة مركبات اختبار بشكل منفصل، في 1.0 milliliter من CRPMI، لتصل إلى ضعف (2x) التركيز النهائي المطلوب.

أضف 200 µL من المركب 1 في الآبار A1-A3، و200 µL من المركب 2 في الآبار A4-A6، و200 µL من المركب 3 في الآبار A7-A9، و200 µL من المركب 4 في الآبار A10-A12. قم بإجراء تخفيف تسلسلي للمركبات المختبرة باستخدام ماصة متعددة القنوات.

ابدأ بنقل 100 µL من الصف A إلى الصف B، ثم اخلط المزيج. وبذلك، استمر في نقل 100 µL من بئر إلى بئر. اخلط بعد كل عملية نقل، وتوقف عند الصف F. بعد الخلط، تخلص من 100 µL من الصف F في حاوية النفايات.

لا تنقل أي سائل إلى الصفين G وH. وأخيراً، أضف 100 microliters من CRPMI إلى كل بئر من آبار اللوحة باستخدام ماصة متعددة القنوات، ليصل الحجم النهائي إلى 200 microliters. أضف 200 microliters من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات إلى لوحة 96-بئر معقمة وجديدة، بحيث تكون أبعاد آبارها مطابقة لأبعاد آبار لوحة بدء تكوين الغشاء الحيوي. بعد ذلك، قم بإزالة الكيس البلاستيكي وفيلم البارافين من لوحة بدء تكوين الغشاء الحيوي التي تم تحضينها.

ارفع الغطاء رأسياً إلى الأعلى، مع تجنب التلامس بين الأوتاد وقاع الطبق، لأن ذلك قد يتلف الغشاء الحيوي. احتفظ بالجزء السفلي لإجراء تحليل OD600 لاحقاً. اشطف الخلايا العائمة عن طريق وضع غطاء الأوتاد فوق الطبق الذي يحتوي على PBS.

اغمر الأوتاد لمدة خمس ثوانٍ. ارفعها من محلول PBS، ثم اغمرها مرة أخرى، مع الحرص على عدم ارتطام الأوتاد بجوانب البئر. ضع غطاء الأوتاد الذي تم شطفه في لوحة التحدي.

تجنب التلامس غير الضروري بين الأوتاد واللوحة السفلية، لأن ذلك سيؤدي إلى تلف الغشاء الحيوي (biofilm)، مما يؤدي إلى نتائج غير متسقة. قم بتغطية اللوحة بفيلم البارافين، ثم ضعها في كيس بلاستيكي قابل للإغلاق كما سبق. قم بتحضين اللوحة، بدون هز، لمدة 24 ساعة عند 37 °C، في حاضنة تحتوي على 5% Carbon Dioxide.

خذ الجزء السفلي من طبق بدء تكوين الغشاء الحيوي (biofilm) وأعد تعليق البكتيريا في كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات. قم بقياس القيمة OD600 باستخدام قارئ صفائح دقيق مناسب، للتأكد من حدوث النمو في جميع الآبار باستثناء ضوابط التعقيم في الصف H. استخدم قارئ صفائح مجهزاً بغرفة تحضين وقادراً على أخذ قراءات الفلورة الحركية (kinetic fluorescence) للكشف عن تحول الريسازورين (resazurin). قم بإعداد قياس فلورة حركي لمدة 24 ساعة باستخدام إثارة بطول موجي 530 nanometer، وانبعاث بطول موجي 590 nanometer.

اضبط درجة حرارة الحجرة على 37 °C، واضبط القارئ لقراءة الطبق كل 20 دقيقة. قم بضبط قارئ الأطباق للقياس من قاع الطبق وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. استعد لغسل الطبق عن طريق إضافة 200 µL من PBS إلى كل بئر في طبق معقم يحتوي على 96 بئراً باستخدام ماصة متعددة القنوات.

بعد ذلك، قم بتحضير وسط استعادة الغشاء الحيوي، وذلك بإضافة 400 µL من المحلول المخزني لـ resazurin بتركيز 0.8 mg/mL إلى 20 mL من وسط CRPMI، ليصل التركيز النهائي لـ resazurin إلى 16 µg/mL. تالياً، أضف 150 µL من وسط استعادة الغشاء الحيوي باستخدام ماصة متعددة القنوات إلى كل بئر في طبق 96 بئراً جديد. انقل طبق التحدي من الحاضنة إلى كابينة السلامة البيولوجية، ثم قم بإزالة الكيس البلاستيكي وفيلم الختم بعناية.

قم بإزالة غطاء المسامير (peg lid) من لوحة التحدي، واشطف الخلايا العائمة في محلول PBS كما سبق، مع الاحتفاظ بقاع لوحة التحدي لتحليل OD600 اللاحق. بعد الشطف، ضع غطاء المسامير في قاع اللوحة الذي يحتوي على وسط استعادة الغشاء الحيوي. قم بلف جانب اللوحة بفيلم البارافين، مع الحرص على عدم سد قاع الآبار المحيطية.

بعد تغليف الطبق مباشرةً، ضعه في قارئ الأطباق، وابدأ قراءة حركية (kinetic read) على مدار 24 ساعة، وذلك عن طريق تشغيل بروتوكول ريزازورين الحركي (resazurin-kinetic protocol) الذي تم إعداده مسبقاً. ولتقدير نمو الخلايا العائمة (planktonic cells) التي قد تحدث أو لا تحدث أثناء التحدي، قم بقراءة قيمة OD600 لقاع طبق التحدي بالكامل باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة. يظهر هنا مثال لتخطيط طبق التحدي، باستخدام تخفيفين كاملين لمعايرة تركيزات المركبات.

عولجت الأغشية الحيوية النامية بمركب النيوكوبروين (neocuproine)، أو بمعقده النحاسي. وأظهرت قراءات الكثافة الضوئية عند طول موجي 600 نانومتر (OD600) لقاع طبق الاختبار بعد 24 ساعة أن معقد النيوكوبروين النحاسي، وليس النيوكوبروين بمفرده، قد منع انفصال ونمو الخلايا الحيوية اللاحق من الأغشية الحيوية المعالجة عند تركيزات 1.25 micromolar أو أعلى. بعد ذلك، تم اختبار الأغشية الحيوية المقابلة باستخدام مقايسة الريسازورين (resazurin assay).

يتيح الفحص البصري بعد مرور 24 ساعة الحصول على إجابة سريعة بنعم أو لا في حال تشغيل عدة أطباق بالتوازي. يتحول لون resazurin إلى الوردي في الآبار التي تحتوي على أغشية حيوية (biofilms) قابلة للحياة، بينما يظل أزرق اللون عندما يتم القضاء على الغشاء الحيوي. ويمكن أن يكشف القياس الحركي لتحول resazurin عن تأثيرات تعتمد على التركيز على حيوية الغشاء الحيوي، كما هو موضح هنا باستخدام gentamicin.

يشير التأخر المعتمد على التركيز في بدء تحول الصبغة إلى انخفاض في حيوية الغشاء الحيوي. وعند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم الحرص على عدم اصطدام الأوتاد بجوانب الآبار.