كفاءة نوكليك حمض استخراج و16S الريباسي جين تسلسل للبكتيريا الجماعة توصيف

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الحمض النووي والحمض النووي الريبي عالي الجودة من المسحات ثم تحديد تركيبهما البكتيري باستخدام تسلسل جيني 16S rRNA. يمكن أن تساعد هذه الطريقة الباحث في تحديد البكتيريا الموجودة في عينة بشرية معينة وتحديد الارتباطات بين بكتيريا معينة وخصائص المضيف أو حالة المرض. على الرغم من أن هذه الطريقة مصممة لتوفير نظرة ثاقبة للمجتمعات البكتيرية المهبلية البشرية ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيق الطريقة لدراسة المجتمعات البكتيرية من مواقع الجسم الأخرى ، مثل الأناح والفم والجلد والمستقيم ومن الكائنات الحية الأخرى.

لاحظ أن هذا الفيديو يسلط الضوء على الأجزاء الأكثر تعقيدا من البروتوكول ولا يغطي جزء التسلسل أو تحليل التسلسل. ستوضح بريتاني بومان ، فنية من مختبري. ابدأ هذا الإجراء بمسحات إكتوسيرفيكال التي تم جمعها وتخزينها على الجليد الرطب كما هو موضح في المستند المصاحب.

استعدادا لاستخراج الحمض النووي ، قم بتنظيف جميع أسطح الغطاء وجميع العناصر التي يتم إحضارها إلى الغطاء باستخدام المبيض متبوعا بمادة مزيلة للتلوث يزيل RNases و DNases و DNA. في غطاء المحرك ، ضع أنبوبا واحدا من الخرز لكل عينة. أضف إلى كل أنبوب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت NaCl-Tris-EDTA ، و 210 ميكرولتر من 20٪ SDS ، و 500 ميكرولتر من كحول إيزوأميل كلوروفورم الفينول.

التعامل الدقيق مع المسحات أمرا بالغ الأهمية للحصول على نتائج واضحة باستخدام هذا البروتوكول. يتطلب نقل المسحة دون إسقاطها القليل من التدريب ، ومن الأسهل إذا كنت تستخدم مسحة مجوفة مثل هذه. باستخدام ملقط معقم ، انقل المسحة من قارورة النقل إلى أنبوب الديكور الخرز.

افركي رأس المسحة جيدا على الجدران الداخلية للأنبوب لمدة 30 ثانية على الأقل. ضع الأنبوب على الثلج. ثم قم بتغيير القفازات وكرر إجراء المسح مع العينة التالية.

بمجرد فرك جميع العينات بقوة ، اتركها تبرد على الجليد لمدة 10 دقائق على الأقل. بعد مرور 10 دقائق لإزالة المسحة ، أمسك المقبض بملاقط معقمة ، وباستخدام طرف P200 نظيف ، اضغط على الرأس على الجزء الداخلي من جدار الأنبوب. هذه العملية مع تحرير السائل من المسحة ، مما يزيد من استعادة الحمض النووي.

ضع أنبوب الديكور المصنوع من الخرزة في حبة الخرز وقم بتجانس العينة لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لأنبوب الديكور المصنوع من الخرزة عند 6 ، 000 جم وأربع درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق لتكسير الحطام وفصل المرحلتين المائية والفينول. بعد الدوران ، يمكن عادة رؤية ثلاث مراحل.

الطبقة العليا هي المرحلة المائية التي تحتوي على الحمض النووي والحمض النووي الريبي. الطبقة السفلية هي المرحلة العضوية ، وتحتوي على الدهون والحطام من الخلايا والمسحات. تحتوي الطبقة الوسطى البيضاء الرقيقة ، التي تسمى الطور البيني ، على البروتين.

انقل المرحلة المائية ، حوالي 500 إلى 600 ميكرولتر ، إلى أنبوب معقم سعة 1.5 مل. أضف كمية متساوية من كحول الفينول كلوروفورم إيزوأميل. امزج عن طريق الانعكاس والدوامة القصيرة.

الطرد المركزي الأنبوب لمدة خمس دقائق. بعد الدوران ، انقل المرحلة المائية إلى أنبوب معقم جديد سعة 1.5 مل. احرص على عدم نقل المواد من الطور البيني أو مرحلة الفينول الأساسية.

لاحظ الحجم المنقول واحفظ مرحلة الفينول لعزل البروتين في المستقبل. بعد ذلك ، أضف 0.8 حجم من الأيزوبروبانول و 0.1 حجم من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولارية. تخلط جيدا عن طريق الانعكاس والدوامة لفترة وجيزة.

قم بترسيب الحمض النووي عن طريق تبريد الأنبوب عند 20 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل وطوال الليل. بعد هطول الأمطار ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 30 دقيقة. بعد الدوران ، استخدم ماصة بعناية لإزالة المادة الطافية ، مع ترك الحبيبات سليمة.

أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. قم بإزالة الحبيبات بدوامة لطيفة أو سحب العينة دون لمس الحبيبات. جهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق.

باستخدام ماصة P10 ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الإيثانول والتخلص منه دون إزعاج الحبيبات. جفف الحبيبات في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أعد تعليق الحبيبات في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت UltraPure 0.1X-Tris-EDTA.

اترك العينة تبرد على الجليد لمدة 10 دقائق والماصة بشكل متكرر لضمان إعادة التعليق الكامل. قم بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي. إذا رغبت في ذلك ، افصل الحمض النووي عن الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة تنظيف العمود باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.

يعد إعداد PCR خطوة حاسمة في هذا الإجراء. من المهم جدا تقليل التلوث من خلال ضمان عقم الكواشف وغطاء PCR والقفازات. اعمل بسرعة ولكن بعناية واستخدم التقنية المناسبة عند نقل العناصر داخل وخارج الغطاء.

ضع رف تبريد نظيف على منضدة لأنابيب الطرد المركزي الدقيق ومبرد لوحة PCR في الغطاء. قم بتسمية الأنابيب الشريطية المكونة من 8 آبار بأغطية فردية وضعها في مبرد PCR. يجب إجراء التضخيم في ثلاث نسخ ويجب تضمين التحكم في المياه بدون قالب لكل زوج أولي.

ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق في المبرد للمزيج الرئيسي. بعد ذلك، لكل عينة، اجمع بين الماء فائق النقاء والمخزن المؤقت 5X HF و DNTPs و 515F التمهيدي الأمامي و 3٪ DMSO كما هو موضح في المستند المصاحب. ثم أضف البوليميراز إلى المزيج الرئيسي واخلطه عن طريق سحب العينات.

إلى البئر الأول ، أضف 90 ميكرولترا من المزيج الرئيسي وميكرولترين من البرايمر العكسي ، واخلطيهم جيدا. ثم إلى البئر الرابع ، الذي يعمل كعنصر تحكم بدون قالب ، أضف 23 ميكرولترا من السيد وميكرولتر من الماء واخلطه. بعد ذلك ، أضف ستة ميكرولترات من العينة المناسبة إلى البئر الأول.

تخلط جيدا وتنقل 25 ميكرولتر إلى البئر الثاني. قم بتغيير النصائح ، ثم انقل 25 ميكرولترا أخرى من البئر الأول إلى البئر الثالث. غطاء كل بئر بإحكام.

احرص على عدم لمس الجزء الداخلي من الآبار أو الغطاء. ثم كرر هذه العملية لكل عينة. بمجرد تحضير جميع العينات ، قم بتدوير الأنابيب الشريطية بسرعة ، وانقلها إلى جهاز التدوير الحراري ، وقم بتشغيل البرنامج.

بعد اكتمال التشغيل ، قم بتدوير الأنابيب بسرعة لجمع السائل من الجدران. بعد ذلك ، على مقعد مختبر نظيف ، اجمع تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ثلاثية النسخ من كل عينة في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم مسمى. انقل 25 ميكرولترا من كل عنصر تحكم بدون قالب إلى أنبوب معقم منفصل.

لا تجمع بين الأمبليكونات من عينات مختلفة حتى الآن. للتحقق من صحة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الناجح ، قم بتحميل خمسة ميكرولترات من كل عينة على هلام الاغاروز بنسبة 1.5٪ وقم بإجراء الرحلان الكهربائي عند 120 فولت لمدة 30 إلى 60 دقيقة. عرض الجل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

تحقق من التضخيم الناجح لكل عينة من خلال ملاحظة نطاق قوي واحد حول 380 زوجا أساسيا. إذا كان هناك نطاق مزدوج ، فأعد تضخيم العينة برمز شريطي عكسي مختلف. إذا لم يكن هناك نطاق على الإطلاق ، فأعد تضخيم العينة إما باستخدام نفس الرمز الشريطي العكسي أو التمهيدي برمز شريطي عكسي جديد.

إذا لم تنجح إعادة التضخيم ، فقد تكون مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل موجودة في العينة ، وفي هذه الحالة ، قم بإجراء تنظيف الحمض النووي المستند إلى العمود لإزالة مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بتخزين 70 ميكرولترا المتبقية من الأمبليكون عند 20 درجة مئوية. تخلص من 20 ميكرولترا المتبقية من عنصر التحكم بدون قالب ، على افتراض أنه لم ينتج عنه نطاق.

لإنشاء تجمع amplicon ، اجمع بين اثنين إلى خمسة ميكرولتر من كل أمبليكون في أنبوب معقم واحد. إذا كان النطاق من العينة ضعيفا ، فأضف ضعف الحجم بالنسبة لبقية العينات. ثم قم بإزالة بادئات PCR باستخدام مجموعة.

إذا كان ذلك ممكنا ، اجمع بين تجمعات amplicon الخالية من التمهيدي لإنشاء المكتبة النهائية. تحديد تركيز الحمض النووي للمكتبة باستخدام مقياس الطيف الضوئي أو نظام القياس الفلوري. أخيرا ، قم بتخفيف العينات إلى اثنين من النانو مولار وأرسلها للتسلسل.

وترد معلومات مفصلة عن تحليل التسلسل في الوثيقة المصاحبة. تم عزل الحمض النووي والحمض النووي الريبي عالي الجودة وتم استخدام الحمض النووي كقالب لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لمنطقة جين 16S rRNA V4 كما هو موضح في هذا الفيديو. تم استخدام الرحلان الكهربائي للهلام لتأكيد وجود نطاق واحد حول 380 زوجا أساسيا في كل عينة تم تضخيمها باستخدام القالب.

لم يكن لعناصر التحكم التي لا توجد قالب تعمل بالتوازي مع نفس زوج التمهيدي نطاق موجود. ثم تم دمج أمبليكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل في أنبوب واحد ، وتحديدها كميا ، وتخفيفها بشكل أكبر قبل التسلسل. يظهر هنا مخطط شريطي تمثيلي لدرجات جودة التسلسل في كل موضع من موضع القراءة.

من الطبيعي أن تنخفض جودة التسلسل بعد 200 زوج أساسي. لكن يجب أن يظل متوسط درجة الجودة أعلى من 30. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الحمض النووي والحمض النووي الريبي من المسحات باستخدام استخراج الفينول الكلوروفورم ، وتضخيم منطقة V4 لجين الحمض النووي الريبي الريبوسومي 16SR ، وإعداد مكتبة للتسلسل عالي الإنتاجية.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم توخي الحذر الشديد لمنع التلوث أثناء جمع العينات واستخراج الحمض النووي وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لا تنس أن العمل باستخدام كلوروفورم الفينول يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل العمل في غطاء التهوية وارتداء قفازات منيعة ونظارات السلامة ذات الدروع الجانبية ومعطف المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.