تجميد البيولوجية الحفازة متعدد في الخرز الجيني للالعامل المساعد تجديد وتحسين إعادة استخدام

الهدف العام من هذا الإجراء التجريبي هو توضيح استخدام نظام تحفيز حيوي متصل لكامل الخلية ومثبت في حبيبات ألجينات لتحسين إنتاجية الإنتاج وإمكانية إعادة الاستخدام. هذا هو موضوعي، حيث أجبت على أسئلة رئيسية في مجال التحفيز الحيوي مثل تثبيت المحفزات الحيوية، والاستقرار، وتجديد العامل المساعد، والمحفزات الحيوية لكامل الخلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر نهجاً بسيطاً ومرناً في آن واحد لتحسين إنتاج العديد من الجزيئات الحيوية الهامة عبر مسارات تعتمد على العامل المساعد.

تُستخدم سلالتان من بكتيريا E coli المؤشبة في هذا البروتوكول: سلالة SpNOx E coli، التي تعبر عن NADH oxidase، وسلالة HjLAD E coli، التي تعبر عن L-arabinitol dehydrogenase. وبما أن هذا الإجراء متماثل لكلتا سلالتي E coli، فسيتم استعراضه فقط باستخدام سلالة HjLAD E coli.

قم بتلقيح مستعمرة واحدة من بكتيريا E coli من سلالة HjLAD في ثلاثة ملليلتر من وسط LB، مضافاً إليه 15 ميكروغرام/ملليلتر من Ket-A-My-Sin، وحضنها طوال الليل في حاضنة هزازة. في اليوم التالي، خفف المزرعة بنسبة 1:100 في 200 ملليلتر من وسط LB جديد يحتوي على 15 ميكروغرام/ملليلتر من Ket-A-My-Sin، وحضنها عند 37 درجة مئوية وبسرعة 250 دورة في الدقيقة حتى تصل قيمة OD 600 إلى حوالي 0.6. قم بتحفيز تعبير بروتين HjLAD عن طريق إضافة 0.1 ملي مولار من IPTG إلى وسط المزرعة، والتحضين عند 25 درجة مئوية، وبسرعة 200 دورة في الدقيقة، لمدة ست ساعات.

قم بحصاد الخلايا المحفزة عن طريق الطرد المركزي عند 3200 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة. تخلص من السائل الطافي، ثم ابدأ بمعالجة كتلة الخلايا كما هو موضح في المقطع التالي. لبدء هذا الإجراء، نقوم بتعليق كتل خلايا HjLAD E coli و SpNox E coli بشكل منفصل في 50 millimolar من منظم Tris-Hcl، بكثافة خلوية تبلغ 5 g من وزن الخلايا الجافة لكل لتر.

في أنبوب مستدير القاعدة سعة 14 milliliter، اخلط 600 µL من بكتيريا HjLAD E coli بتركيز 5 g dry cell weight/L، و600 µL من بكتيريا SpNOx E coli بتركيز 5 g dry cell weight/L، و100 µL من NAD+ بتركيز 20 mM، و150 µL من L-aribinitol بتركيز 2 M. اجعل حجم التفاعل 2 mL بإضافة 550 µL من Tris-HCl بتركيز 50 mM. قم بحضن خليط التفاعل عند 30 °C وبسرعة 200 RPM لمدة ثماني ساعات.

بعد مرور ثماني ساعات، يتم طرد الخليط مركزياً عند 3200 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق، ثم يتم جمع الراشح الناتج عن التفاعل. ولتقدير كمية إنتاج L-xylulose بواسطة مقايسة لونية، يتم سحب 100 µL من الراشح الذي تم جمعه ووضعه في أنبوب سعة 1.5 mL. يُضاف 50 µL من السيستين بتركيز 1.5%، و900 µL من حمض الكبريتيك بتركيز 70%، و50 µL من Kar-Piz-All بتركيز 0.1% المذاب في الإيثانول، ثم يُمزج الخليط بلطف عن طريق قلب الأنبوب ثلاث مرات.

يُحضن خليط التفاعل عند 37 درجة Celsius وبسرعة 200 RPM لمدة 20 دقيقة. تُقاس الامتصاصية الضوئية لخليط التفاعل عند 560 nanometers باستخدام مقياس الطيف الضوئي. ابدأ بروتوكول التثبيت عن طريق تحضير محلول ألجينات بتركيز 4%.

أضف 0.8 grams من ألجينات الصوديوم إلى 20 milliliters من الماء المقطر، وسخن الخليط لإذابة ألجينات الصوديوم. أضف 600 µL من بكتيريا HjLAD E coli بتركيز خمسة جرام من وزن الخلايا الجافة لكل لتر، و600 µL من بكتيريا SpNOx E coli بتركيز خمسة جرام من وزن الخلايا الجافة لكل لتر إلى 1.2 milliliters من محلول الألجينات بتركيز 4%. اخلط الخلايا والألجينات عن طريق السحب اللطيف بالماصة لتجنب تكون الفقاعات.

لضمان تكوين حبيبات ألجينات ذات حجم وشكل وصلابة موحدة، من الضروري إضافة معلق الخلايا في الألجينات من مسافة مثالية وبطريقة تقطيرية بطيئة، في حجم كافٍ من محلول كلوريد الكالسيوم بحيث يغطي جميع الحبيبات. اسحب معلق الخلايا في الألجينات إلى محقنة باستخدام إبرة، ثم أضف الخليط قطرة تلو الأخرى في محلول كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.3 مولار في دورق سعة 100 ملليلتر مع التحريك المستمر. اترك الحبيبات في محلول كلوريد الكالسيوم لمدة تتراوح بين ساعتين إلى ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة دون تحريك للسماح بحدوث عملية الربط التشعبي.

قم بسكب محلول كلوريد الكالسيوم دون تحريك الخرزات عن طريق صب محلول كلوريد الكالسيوم بعناية في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. انقل الخرزات المتبقية إلى أنبوب مخروطي آخر سعة 50 milliliter. ولإزالة كلوريد الكالسيوم الزائد والخلايا غير المغلفة، اغسل الخرزات باستخدام محلول Tris-HCl المنظم بتركيز 50 millimolar.

أضف 10 milliliters من المحلول المنظم إلى الخرزات، واترك المعلق دون تحريك لمدة تتراوح بين ثلاث إلى خمس دقائق. وبمجرد استقرار الخرزات في القاع، صب المحلول المنظم في وعاء آخر. كرر عملية غسل الخرزات بهذه الطريقة ثلاث مرات.

لا تقم بطرد الخرزات مركزياً في أي خطوة، وإلا ستتمزق. لا تتخلص من محلول الغسيل المستعمل Tris-HCl، بل اسحب 30 milliliters من محلول الغسيل المستعمل مع محلول كلوريد الكالسيوم المستعمل الذي تم جمعه سابقاً.

قم بترسيب خلايا E coli غير المثبتة عن طريق طرد مركزي لمحلول كلوريد الكالسيوم وTris-HCl المسحوب عند 3200 ×g لمدة 20 دقيقة. انقل الخرزات المغسولة إلى أنبوب. بعد ذلك، قم بتقييم الاصطناع الحيوي لـ L-xylulose باتباع الإجراء الموضح لكرات الخلايا المترسبة، ولكن باستخدام جميع الخرزات المغسولة بدلاً من كرات الخلايا المترسبة.

لتقييم استقرار المحفزات الحيوية المثبتة لإنتاج L-xylulose، اجمع الخرزات بعد تشكلها. واغسلها مرتين باستخدام 10 milliliters من Buffer Tris-HCl بتركيز 50 millimolar دون إجراء طرد مركزي كما تم توضيحه سابقاً. استخدم جميع الخرزات المغسولة لإجراء تفاعل إنتاج L-xylulose كما تم شرحه سابقاً.

قم بقياس كمية إنتاج L-xylulose عن طريق مقايسة لونية، كما تم توضيحه سابقاً. كرر تفاعل إنتاج L-xylulose لعدد دورات الإنتاج المطلوبة، وقس كمية L-xylulose الناتجة في السائل الطافي للتفاعل في كل دورة. يتم تعزيز إنتاج L-xylulose بواسطة هذا النظام التحفيزي الحيوي المزدوج للخلايا الكاملة.

بدءًا من تركيز أولي قدره 150 millimolar من L-aribinitol، أدى استخدام المحفز الحيوي HjLAD E coli وحده إلى إنتاج مردود بنسبة 79% من L-xylulose. وفي المقابل، أدى استخدام خلايا HjLAD E coli و SpNOx E coli بنسبة واحد إلى واحد إلى إنتاج مردود بنسبة 96% من L-xylulose. وكشف تقييم المعايير التي تؤثر على كفاءة تثبيت المحفز الحيوي أن الكفاءة تزداد مع زيادة تركيز ألجينات الصوديوم في النطاق من واحد إلى ثلاثة بالمائة.

ومع ذلك، فإن تركيزات ألجينات الصوديوم التي تزيد عن 2% تؤدي إلى انخفاض مردود L-xylulose. وباستخدام تركيز 2% من ألجينات الصوديوم، تم تحديد التركيز الأمثل لكلوريد الكالسيوم للتثبيت ومردود L-xylulose بـ 0.3 molar. كما تم تقييم إمكانية إعادة استخدام المحفز الحيوي.

في هذا الرسم البياني، يظهر إنتاج L-xylulose لسبع دورات متتالية من إعادة استخدام المحفزات الحيوية المكونة من خلايا كاملة مقترنة ومثبتة باللون الرمادي الداكن، والخلايا الكاملة المقترنة الحرة باللون الرمادي الفاتح، على التوالي. وعلى الرغم من أن الحد الأقصى لعائد L-xylulose بواسطة المحفزات الحيوية المكونة من خلايا كاملة مقترنة ومثبتة أقل منه في نظام الخلايا الكاملة المقترنة الحرة، إلا أن إمكانية إعادة الاستخدام تتحسن من خلال التثبيت. وفي نهاية سبع دورات من إعادة الاستخدام المتتالي، حافظت المحفزات الحيوية المثبتة على استقرارها، واحتفظت بنسبة 65% من عائد L-xylulose الأصلي.

بعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التحفيز الحيوي لاستكشاف إنتاجية المحفزات الحيوية متعددة الخلايا الكاملة، والتفاعلات الرئيسية التي تتضمن العوامل المساعدة.