تجميد البيولوجية الحفازة متعدد في الخرز الجيني للالعامل المساعد تجديد وتحسين إعادة استخدام

الهدف العام من هذا الإجراء التجريبي هو إثبات استخدام نظام تحفيزي حيوي مقترن بخلية كاملة يثبت في حبات الجينات لتحسين إنتاجية الإنتاج وقابلية إعادة الاستخدام. هذا هو موضوعي ، لقد أجبت على الأسئلة الرئيسية في مجال التحفيز الحيوي مثل تثبيت المحفزات الحيوية ، والاستقرار ، وتجديد العامل المساعد ، والمحفزات الحيوية للخلية الكاملة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر نهجا بسيطا ومرنا لتحسين إنتاج العديد من الجزيئات الحيوية المهمة عن طريق المسارات المعتمدة على العامل المساعد.

يتم استخدام سلالتين مؤتلفتين من الإشريكية القولونية في هذا البروتوكول. SpNOx E قولونية ، التي تعبر عن NADH oxidase ، و HjLAD E coli ، التي تعبر عن نازعة هيدروجين L-arabinitol. نظرا لأن هذا الإجراء هو نفسه لكل من سلالات الإشريكية القولونية ، إثباته فقط ل HjLAD E coli.

تلقيح مستعمرة واحدة من HjLAD E coli في ثلاثة ملليلتر من وسط LB ، مع استكمال 15 ميكروغرام لكل مليلتر من Ket-A-My-Sin ، واحتضانها طوال الليل في شاكر حاضنة. في اليوم التالي ، قم بتخفيف المزرعة بمقدار واحد إلى 100 في 200 مل من LB الطازج الذي يحتوي على 15 ميكروغرام لكل مليلتر من Ket-A-My-Sin ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية عند 250 دورة في الدقيقة حتى يصل OD 600 إلى حوالي 0.6. تحفيز التعبير عن بروتين HjLAD عن طريق إضافة 0.1 مللي مولار IPTG إلى وسط الاستزراع ، واحتضانه عند 25 درجة مئوية ، 200 دورة في الدقيقة ، لمدة ست ساعات.

حصاد الخلايا المستحثة عن طريق الطرد المركزي عند 3200 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. تخلص من المادة الطافية ، واستمر في معالجة حبيبات الخلية كما هو موضح في الجزء التالي. لبدء هذا الإجراء ، نقوم بتعليق كريات الخلايا من HjLAD E coli و SpNox E coli بشكل منفصل في 50 ملليمولار من المخزن المؤقت Tris-Hcl ، بكثافة خلية تبلغ خمسة جرامات من وزن الخلية الجافة لكل لتر.

في أنبوب قاع دائري سعة 14 مليلتر ، امزج 600 ميكرولتر من وزن الخلية الجافة بمقدار خمسة جرام لكل لتر HjLAD E coli ، و 600 ميكرولتر من وزن الخلية الجافة بخمسة جرام لكل لتر SpNOx E قولونية ، و 100 ميكرولتر من 20 ملليمولار NAD زائد ، و 150 ميكرولتر من اثنين من L-aribinitol المولار. ارفع حجم التفاعل إلى ملليلترين عن طريق إضافة 550 ميكرولتر من 50 ملليمولار Tris-HCl. احتضان خليط التفاعل عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة ثماني ساعات.

بعد ثماني ساعات ، قم بالطرد المركزي للخليط عند 3200 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، واجمع المادة الطافية للتفاعل. لتحديد إنتاج L-xylulose عن طريق مقايسة اللون، قم بشفط 100 ميكرولتر من المادة الطافية المجمعة في أنبوب 1.5 ملليتر. أضف 50 ميكرولتر من 1.5٪ سيستين ، و 900 ميكرولتر من 70٪ من حمض الكبريتيك ، و 50 ميكرولتر من 0.1٪ Kar-Piz-All المذاب في الإيثانول ، واخلطهم برفق عن طريق قلب الأنبوب ثلاث مرات.

احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة. قم بقياس الامتصاص البصري لخليط التفاعل عند 560 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. ابدأ بروتوكول الشلل بإعداد محلول الجينات بنسبة 4٪.

أضف 0.8 جرام من ألجينات الصوديوم إلى 20 مل من الماء المقطر ، وقم بتسخين الخليط لإذابة ألجينات الصوديوم. أضف 600 ميكرولتر من خمسة غرامات من وزن الخلية الجافة لكل لتر HjLAD E قولونية ، و 600 ميكرولتر من وزن الخلية الجافة خمسة جرام لكل لتر SpNOx E coli إلى 1.2 مل من محلول الجينات 4٪. امزج الخلايا وألجينات عن طريق سحب العينة اللطيف لتجنب تكوين الفقاعات.

لضمان تكوين حبات الجينات ذات الحجم الموحد والتشكل والصلابة ، من الأهمية بمكان إضافة تعليق الجينات الخلوي لمسافة مثالية بطريقة بطيئة ومتساقطة ، إلى حجم كاف من محلول كلوريد الكالسيوم لتغطية جميع الخرز. قم بشفط معلق خلية الجينات في حقنة باستخدام إبرة ، ثم أضف الخليط إلى محلول كلوريد الكالسيوم 0.3 مولار في دورق 100 مل مع التحريك المستمر. اترك الخرزات في محلول كلوريد الكالسيوم لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة دون تقليب للسماح بالربط المتقاطع بالمقاييس.

صب محلول كلوريد الكالسيوم دون إزعاج الخرزات عن طريق صب محلول كلوريد الكالسيوم بعناية في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. انقل الخرزات المتبقية إلى أنبوب مخروطي آخر سعة 50 مل. لإزالة كلوريد الكالسيوم الزائد والخلايا غير المغلفة ، اغسل الخرزات بمحلول 50 ملليمولار Tris-HCl.

أضف 10 مل من المخزن المؤقت إلى الخرز ، واترك التعليق يقف دون إزعاج لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. بمجرد أن تستقر الخرزات في الأسفل ، صب المخزن المؤقت في حاوية أخرى. بهذه الطريقة ، اغسل الخرز ثلاث مرات.

لا تقم بالطرد المركزي للحبات في أي خطوة وإلا ستتمزق. لا تتخلص من محلول الغسيل Tris-HCl المستخدم. اسحب 30 مل من محلول الغسيل المستخدم باستخدام محلول كلوريد الكالسيوم المستخدم الذي تم جمعه مسبقا.

حبيبات خلايا الإشريكية القولونية غير المجمدة عن طريق الطرد المركزي لكلوريد الكالسيوم المسحوب ومحلول Tris-HCl عند 3200 مرة جم لمدة 20 دقيقة. انقل الخرزات المغسولة إلى أنبوب. بعد ذلك, تقييم التخليق الحيوي ل L-xylulose باتباع الإجراء الموضح لحبيبات الخلية ولكن باستخدام جميع الخرزات المغسولة بدلا من كريات الخلية.

لتقييم استقرار المحفزات الحيوية المجمدة لإنتاج L-xylulose ، اجمع الخرزات بعد تكوينها. واغسلها مرتين باستخدام 10 ملليلتر من 50 ملليمولار Tris-HCl المؤقت بدون طرد مركزي كما هو موضح سابقا. استخدم كل الخرزات المغسولة لإجراء التفاعل لإنتاج L-xylulose كما هو موضح سابقا.

حدد إنتاج L-xylulose عن طريق مقايسة اللون، كما هو موضح سابقا. كرر تفاعل إنتاج L-xylulose للعدد المطلوب من دورات الإنتاج ، وقم بقياس كمية L-xylulose المنتجة في المادة الطافية للتفاعل في كل دورة. يتم تعزيز إنتاج L-xylulose من خلال هذا النظام الحيوي المقترن بالخلية الكاملة.

بدءا من التركيز الأولي البالغ 150 ملليمولار L-aribinitol ، أنتج استخدام المحفز الحيوي HjLAD E coli وحده عائدا قدره 79٪ L-xylulose. وبالمقارنة ، فإن استخدام خلايا HjLAD E coli و SpNOx E coli بنسبة واحد إلى واحد أنتج عائدا بنسبة 96٪ L-xylulose. كشف تقييم للمعلمات المؤثرة على كفاءة تثبيت المحفز الحيوي أن الكفاءة تزداد مع زيادة تركيز ألجينات الصوديوم في حدود واحد إلى ثلاثة بالمائة.

ومع ذلك ، فإن تركيزات ألجينات الصوديوم الأكبر من 2٪ تؤدي إلى انخفاض إنتاجية L-xylulose باستخدام تركيز ألجينات الصوديوم بنسبة 2٪ ، تم تحديد تركيز كلوريد الكالسيوم الأمثل للتثبيت وعائد L-xylulose على أنه 0.3 مولار. تم تقييم قابلية إعادة استخدام المحفز الحيوي.

في هذا الرسم البياني ، يظهر إنتاج L-xylulose لسبع دورات متتالية من إعادة استخدام المحفزات الحيوية للخلايا الكاملة المجمدة والحرة المقترنة باللون الرمادي الداكن والفاتح ، على التوالي. على الرغم من أن الحد الأقصى لعائد L-xylulose عن طريق المحفزات الحيوية للخلية الكاملة المقترنة المجمدة أقل من نظام الخلية الكاملة المقترن الحر ، إلا أن قابلية إعادة الاستخدام تتحسن عن طريق الشلل. في نهاية سبع دورات من إعادة الاستخدام المتتالية ، حافظت المحفزات الحيوية المجمدة على استقرارها ، واحتفظت بنسبة 65٪ من محصول L-xylulose الأصلي.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التحفيز الحيوي لاستكشاف غلة المحفزات الحيوية الكاملة متعددة الخلايا ، والتفاعلات الرئيسية التي تنطوي على العوامل المساعدة.