عزل وتوصيف من الرأس والرقبة قشري سرطان الخلايا حيوانية وجود الجذعية خصائص الخلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الجذعية السرطانية من سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة أو خطوط خلايا HNSCC. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علاج السرطان حول كيفية استخدام العلاج الكيميائي للتغلب على المقاومة الإشعاعية للورم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم مجموعة من العلامات لتحقيق خصوصية عالية في الخلايا الجذعية السرطانية من خطوط خلايا HNSCC.

سيتم توضيح الإجراء من قبل Prescillia Battiston-Montagne الفني لدينا وماريون جيلورميني ، دكتوراه من مختبري. لتحديد مجموعة جانبية من الخلايا الجذعية السرطانية عن طريق اختبار تدفق صبغة Hoechst ، قم أولا بتسمية أنبوب مخروطي واحد Hoechst وواحد Hoechst و Verapamil. بعد ذلك ، اغسل مزرعة خلية HNSCC باستخدام PBS معقم متبوعا بإضافة مليلتر واحد من Tripsyn EDTA.

بعد ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية ، أوقف التفاعل مع وسط زراعة الخلايا الطازجة وعد الخلايا. تمييع الثقافة إلى واحد في 10 إلى الخلايا السابعة لكل مليلتر ووسط خط الخلية الأبوية كاملة. ثم أضف 100 ميكرولتر إلى أنبوب Hoechst و Verapamil وأربعة ملليلتر من الخلايا إلى أنبوب Hoechst.

بعد ذلك ، امزج برفق 10 ميكرولترات من محلول هيدروكلوريد فيراباميل خمسة مللي مولار في عينة Hoechst و Verapamil متبوعا بخمسة ميكرولترات من Hoechst لكل مرة واحدة في 10 إلى الخلايا السادسة لكلا الأنبوبين. ثم غطي العينات بورق الألمنيوم وضعيها على حرارة 37 درجة مئوية. بعد 90 دقيقة ، مع الخلط اللطيف كل 15 دقيقة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب وإعادة تعليق الكريات في ملليلترين من PBS.

بعد الطرد المركزي المركزي ، قم بإعادة تعليق حبيبات Hoechst و Verapamil في 500 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم في PBS وحبيبات Hoechst في أربعة ملليلتر من نفس الشيء. الآن قم بتصفية العينات من خلال مصافي خلايا 70 ميكرون في أنابيب FACS لإزالة أي مجاميع ووضع العينات على الجليد المحمي من الضوء. بعد ذلك ، قم بتحميل عينة Hoechst على مقياس التدفق الخلوي وافتح نافذة ورقة العمل العالمية في برنامج مقياس التدفق الخلوي.

انقر فوق Dot Plot لإنشاء رسم بياني في ورقة العمل العالمية وانقر بزر الماوس الأيمن لتحديد معلمات المبعثر الأمامي والجانبي. قم بإنشاء مبعثر جانبي عريض بواسطة مخطط نقطة ارتفاع مبعثر جانبي بنفس الطريقة ثم انقر فوق بوابة المضلع لإنشاء منطقة P1 في الرسم البياني الثاني لتحديد الخلايا المفردة وتمييز الزوجي. بعد ذلك ، قم بإنشاء منطقة Hoechst حمراء بواسطة مخطط نقطة منطقة Hoechst أزرق وانقر بزر الماوس الأيمن على الخلايا لتمييز مجموعة P1.

ثم قم بإنشاء منطقة P2 لتحديد مجموعة الخلايا السلبية لصبغة Hoechst التي تظهر كذراع جانبي على يسار المجموعة الرئيسية للخلايا وجمع 10،000 من أحداث عينة Hoechst. للتأكد من أن البوابة P2 التي تمثل المجموعة الجانبية قد تم وضعها بشكل صحيح ، قم بجمع 10،000 حدث عينة من Hoechst و Verapamil أيضا. يجب أن يختفي السكان الجانبيون.

ثم قم بفرز المجموعة الجانبية للخلايا السلبية لصبغ Hoechst إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على مليلتر واحد من وسط الخلية الجذعية الكاملة للسرطان. في نهاية الفرز ، قم بتدوير الخلايا وإعادة تعليق الحبيبات الجانبية في مليلتر واحد من وسط الخلايا الجذعية الكاملة للسرطان. ثم عد الخلايا وبذرها بالرقم المناسب في قارورة ثقافة خلية جديدة.

لتحديد المجموعة الفرعية CD44-high/ALDH-high من الخلايا الجانبية التي تم فرزها ، قم أولا بتسمية سبعة أنابيب مخروطية معقمة سعة 15 مليلتر كما هو موضح. بعد ذلك ، قم بتخفيف الخلايا المصنفة إلى واحد في 10 إلى الخلايا السبع لكل مليلتر في وسط الخلايا الجذعية وقم بنقل 100 ميكرولتر من الخلايا إلى أنابيب CD44-APC و IGG1-APC غير الملوثة وأربعة ملليلتر من الخلايا إلى أنبوب ALDH و CD44-APC ، كل ذلك على الجليد. قم بتدوير الخلايا وإعادة تعليق كريات CD44-APC و IGG1-APC غير الملوثة في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت واحد من مجموعة ALDEFLUOR.

ثم أضف خمسة ميكرولترات من مثبط ALDH DEAB إلى أنابيب ALDH و DEAB و ALDH DEAB و CD44-APC. أعد تعليق الخلايا الموجودة في أنبوب ALDH و CD44-APC في أربعة ملليلتر من الكاشف C الذي يحتوي على أربعة ملليلتر من العازلة واحد و 20 ميكرولتر من الكاشف من المجموعة ونقل 100 ميكرولتر من هذه الخلايا على الفور إلى أنابيب ALDH و ALDH و DEAB و CD44-APC. ثم ضع جميع الأنابيب في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة محميا من الضوء ، وخلط العينات بعد 15 دقيقة عن طريق دوامة لطيفة.

في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي لجميع العينات وتخلص من المواد الطافية. ثم ضع جميع الأنابيب على الجليد وأعد تعليق حبيبات ALDH و CD44-APC في أربعة ملليلتر من المخزن المؤقت A و CD44-APC و ALDH DEAB و CD44-APC في 100 ميكرولتر من نفس الشيء. أعد تعليق حبيبات IGG1-APC في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت B وأنابيب ALDH و ALDH و DEAB غير الملوثة في 100 ميكرولتر من العازلة الأولى.

بعد 10 دقائق ، قم بتدوير جميع العينات مرة أخرى متبوعة بغسل في 1 مليلتر من المخزن المؤقت واحد لجميع العينات باستثناء عينة ALDH و CD44-APC ، والتي يتم غسلها في أربعة ملليلتر من المخزن المؤقت الأول. بعد الطرد المركزي الثاني ، أعد تعليق جميع الكريات في مليلتر واحد من العازلة الطازجة باستثناء عينة ALDH و CD44-APC ، والتي يتم تعليقها في أربعة ملليلتر من العازلة الأولى. الآن قم بتحميل أنبوب ALDH و CD44-APC على مقياس التدفق الخلوي وقم بإنشاء APC بواسطة مخطط نقطة fitsy لتصور السكان الملطخين المزدوجين.

بعد ذلك ، قم بتحميل أنبوب ALDH لإنشاء بوابة لخلايا ALDH العالية. يجب أن تختفي الخلايا الموجبة عند تحميل أنبوب ALDH و DEAB. في نفس الرسم البياني ، قم بإنشاء بوابة ثانية باستخدام أنابيب CD44-APC و IGG1-APC لتحديد الخلايا التي تحتوي على ارتفاع CD44.

ستختفي الخلايا الموجبة عند تحميل أنبوب IGG1-APC. ثم قم بتحميل أنابيب ALDH و CD44-APC و ALDH DEAB و CD44-APC لإنشاء بوابة ثالثة تتضمن خلايا CD44-عالية / ALDH-عالية. استخدم أنبوب ALDH-CD44 مزدوج التلوين لوضع البوابة الأخيرة على الخلايا الإيجابية المزدوجة.

ثم قم بفرز الخلايا CD44-عالية / ALDH-العالية في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من وسط الخلية الجذعية الكاملة للسرطان الذي يجمع خلايا CD44-منخفضة / ALDH-منخفضة في مليلتر واحد من وسط زراعة الخلايا الكامل حسب الرغبة. بعد الفرز الثاني ، قم بوضع الخلايا عالية CD44 / ALDH العالية في قارورة مزرعة خلوية مناسبة مع وسط خلوي جذعي كامل يشبه السرطان في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 18 إلى 24 ساعة. عندما تلتصق الخلايا بالجزء السفلي من القارورة ، قم بتغيير وسط الثقافة وأعد القارورة إلى الحاضنة.

لتأكيد إمكانات الورم للخلايا العالية CD44 / ALDH العالية ، قم بتربسين الطبقة الأحادية الشبيهة بجذع السرطان كما هو موضح للحصول على تعليق أحادي الخلية ونقل مرة واحدة 10 إلى الخلايا الست إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. بعد تدوير الخلايا ، أعد تعليق الحبيبات في وسط منخفض المصل مكملا بعامل نمو البشرة البشري المؤتلف الهيبارين و B27 واحتضان الخلايا في طبق بتري منخفض التثبيت في حاضنة زراعة الخلايا حتى يتم ملاحظة مجالات الورم بواسطة الفحص المجهري البصري. عندما يتم إجراء الفرز لأول مرة على خط خلوي جديد ، من الضروري تأكيد إمكانات الورم لخط الخلية كما يتضح من قدرته على تكوين مجالات الورم في وسط خال من المصل في المختبر.

علاوة على ذلك ، يجب أن يظهر QPCR تعبيرا عاليا عن بيتا كاتينين وعلامات الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية الأخرى بواسطة خلايا CD44-عالية / ALDH-عالية. يجب أن تكون الخلايا عالية CD44 / ALDH عالية أيضا قادرة على تكوين أورام في الموقع عند حقنها بكميات منخفضة مقارنة بالخلايا CD44 المنخفضة / ALDH المنخفضة. بمجرد إتقانها ، يجب أن يكون من الممكن إكمال كل فرز للخلايا في غضون خمس ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر حماية العينات التي تحمل علامة الفلوروكروم من التعرض المباشر للضوء. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات هجرة الغزو للإجابة على أسئلة إضافية حول مشاركة الخلايا الجذعية السرطانية في العملية النقيلية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال السرطان لاستكشاف آليات هروب الورم في سرطان HNSCC.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا الجذعية السرطانية من خطوط خلايا HNSCC باستخدام التحليل الخلوي متعدد البارامترات وفرز الخلايا. لا تنس أن العمل مع الخلايا السرطانية وإقحام عوامل الحمض النووي يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأن الاحتياطات مثل ارتداء معطف المختبر والقفازات يجب دائما اتخاذ هذا الإجراء.