طريقة سريعة لمعالجة الدم إلى زيادة الغلة من مستويات البلازما الببتيد في الدم البشري

الهدف العام من هذه الطريقة RAPID هو تحسين إنتاج هرمونات الببتيد الذاتية ليتم قياسها في دم الإنسان. تم إنشاء طريقة RAPID مؤخرا للاستخدام في الفئران ، وهي مناسبة أيضا للاستخدام في دم الإنسان. تعمل طريقة RAPID على تحسين المحصول ، وتسمح باكتشاف الشكل الجزيئي الصحيح للببتيد الداخلي.

طريقة RAPID سهلة الاستخدام. ومع ذلك ، فإن طريقة RAPID تستغرق وقتا أطول وأكثر تكلفة مقارنة بأخذ عينات الدم القياسية. لذلك قد يكون أكثر قابلية للتطبيق في بيئة البحث.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث أن تخفيف العينات في الوقت المناسب بالإضافة إلى الشطف له أهمية كبيرة لضمان مستوى الببتيد المناسب. جمع الدم الوريدي في وقت موحد بعد صيام الليل من وريد الساعد. والعملية وفقا للإجراءات القياسية ، أو طريقة RAPID.

اطلب من الأشخاص عدم ممارسة الرياضة أو التدخين قبل سحب الدم. للمعالجة القياسية ، قم بجمع الدم في أنابيب EDTA مبردة تحتوي على أنابيب وأجهزة طرد مركزي في غضون 10 دقائق عند 3000 جي ثانية لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. اجمع المادة الطافية ، واحتفظ بها تحت الصفر 80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة عن طريق المقايسة المناعية الإشعاعية.

للمعالجة السريعة ، قم بتخفيف الدم على الفور من واحد إلى 10 ، في عازلة RAPID الباردة. درجة الحموضة ثلاث نقاط ستة ، تحتوي على صفر نقطة واحدة أمونيوماسيتات المولية. نقطة الصفر خمسة كلوريد الصوديوم المولي ومثبطات الإنزيم.

في غضون 10 دقائق، قم بالطرد المركزي للعينة RAPID عند 3000 Gs لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية، واجمع المادة الطافية باستخدام ماصة. بعد ذلك ، قم بشحن خراطيش الكروماتوغرافيا بنسبة 100٪ أكسيتونيتريل ، بمعدل 10 ملليلتر في الدقيقة. بعد التوازن مع 0.1٪ ثلاثي فلورو أسيتيك ، أو TFA.

قم بالتحميل باستخدام المادة الطافية للعينة RAPID ، بمعدل ثابت قدره مليلتر واحد في الدقيقة ، باستخدام مضخة حقنة. بعد غسل الخراطيش بثلاثة ملليلتر من 0.1٪ TFA ، بمعدل 10 ملليلتر في الدقيقة ، قم بإخراج عينة RAPID ببطء بمليلترين من 70٪ أسيتونيتريل يحتوي على 0.1٪ TFA ، بمعدل ملليلترين في الدقيقة. جفف العينات المخففة باستخدام الطرد المركزي الفراغي ، وخزنها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر ، حتى مزيد من المعالجة عن طريق المقايسة المناعية الإشعاعية.

الحصول على اليود 125 راديو المسمى الببتيدات البشرية. احتفظ بالببتيدات في شكل مسحوق حتى التجربة. ثم يخفف طازجا في 0.1٪ حمض الأسيتيك.

للمعالجة القياسية ، مباشرة بعد سحب الدم ، إلى أنابيب مبردة تحتوي على EDTA ، قم بنقل مليلتر واحد من الدم في أنبوب به 50 ميكرولتر من الملصق الإشعاعي ، يحتوي على 3000 إلى 6000 دورة في الدقيقة. للمعالجة السريعة ، قم بنقل مليلتر واحد من EDTA يحتوي على دم إلى أنبوب يحتوي على تسعة ملليلتر من المخزن المؤقت السريع ، و 500 ميكرولتر من الملصق الراديوي يحتوي على 30،000 إلى 60،000 CPM. نظرا للتخفيف من واحد إلى 10 ، استخدم حجما أكبر بمقدار 10 مرات من الملصق الراديوي للمعالجة السريعة.

مباشرة بعد تطبيق الخطوات المختلفة لطريقة RAPID ، قم بتقييم استعادة الببتيدات ذات العلامات المشعة باستخدام عداد جاما. لا تجفف العينات عن طريق الطرد المركزي بالفراغ ، وقم بتخزين الملاحظات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. للقياس ، انقل المادة الطافية إلى أنابيب مثبتة في عداد جاما.

وتقييم الأعداد في الدقيقة. قم بقياس المادة الطفية بالكامل في عينات قياسية. في عينات RAPID ، قم بتحليل عشر الحجم الكلي لتحقيق كمية مماثلة من الملصقات الراديوية المستخدمة.

كمعيار 100٪ ، استخدم عينتين مع 50 ميكرولتر من الببتيد اليود 125 المصنف بالإشعاع التي لا تخضع للمعالجة. قم بقياس النشاط الإشعاعي لجميع العينات في نفس الوقت. سحب الدم ، في أنابيب مبردة تحتوي على EDTA ، ونقل مليلتر واحد إلى أنابيب تحتوي على 200 ميكرولتر من أسيل جريلين الملصق بالإشعاع ، والذي يحتوي على 15،000 إلى 20،000 دورة في الدقيقة ، للمعالجة القياسية.

للمعالجة السريعة ، قم بنقل مليلتر واحد من الدم إلى أنبوب يحتوي على تسعة ملليلتر من المخزن المؤقت السريع ، و 200 ميكرولتر من أسيل جريلين الملصق بالإشعاع يحتوي على 15،000 إلى 20،000 جزء في الدقيقة. بعد ذلك ، قم بمعالجة العينات كما كان من قبل. لمزيد من التحليل بواسطة HPLC المعكوس ، قم بتحميل العينات مباشرة على عمود رابطة مستقرة C18 متوازن في 17٪ أسيتونيتريل في الماء مكمل بنسبة 0.1٪ TFA.

بعد خمس دقائق من التوازن ، استخدم تدرجا من 17 إلى 40٪ أسيتونيتريل ، لتصفية العينة في 40 دقيقة ، بمعدل واحد مليلتر في الدقيقة. اجمع كسور من مليلتر واحد كل دقيقة ، وحلل النشاط الإشعاعي باستخدام عداد جاما. في تجربة منفصلة ، قم بتحميل 200 ميكرولتر من أسيل جريلين المسمى بالإشعاع الذي يحتوي على 15 ، 000 إلى 20 ، 000 ألف دورة في الدقيقة على العمود مباشرة وقم بإجراء HPLC كما كان من قبل.

للمقايسة المناعية الإشعاعية ، قم بإذابة المواد الطافية المجمدة والمسحوق المجفف بالتفريغ في درجة حرارة الغرفة. مباشرة قبل المقايسة المناعية الإشعاعية ، أعد تعليق عينات RAPID الجافة في الماء المقطر المزدوج ، وفقا للحجم الأصلي للبلازما. قم بتقييم كيسببتين والجريلين الكلي بالإضافة إلى أسيل جريلين ، باستخدام المقايسات الإشعاعية التجارية وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.

استخدم أنابيب البورسليكات التي تسمح بتكوين لوحة مستقرة. في اليوم الأول ، احتضان العينات مع المخزن المؤقت للفحص ، والجسم الأساسي ، في التخفيف الذي توفره الشركة المصنعة لمدة 24 ساعة. في اليوم الثاني ، أضف اليود 125 التتبع ، الدوامة ، واحتضن لمدة 24 ساعة.

في اليوم الثالث ، أضف الكاشف المسرب والدوامة واحتضنه على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 3 ، 000 جي لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المواد الطافية واحسب النشاط الإشعاعي في اللوحات باستخدام عداد جاما.

احسب ديساسيل جريلين ، كفرق إجمالي الجريلين مطروحا منه أسيل جريلين. يقيم نسبة الأسيل ، ديساسيل جريلين ، عن طريق غوص الأسيل بواسطة ديساسيل جريلين لكل عينة على حدة. إذا أمكن ، قم بمعالجة جميع العينات في دفعة واحدة ، لتجنب التباين بين المقايسة.

معالجة الدم السريعة من إنتاج الببتيدات اليود 125 ذات العلامات المشعة في دم الإنسان ، مقارنة بمعالجة الدم القياسية. بعد معالجة الدم القياسية ، تراوح استرداد الببتيدات ذات العلامات الإشعاعية من 48٪ إلى 68٪ في تسعة ببتيدات. أدت المعالجة السريعة إلى تحسين المحصول في جميع الببتيدات المسماة باليود 125 ، مع استرداد يتراوح من 71٪ إلى 98٪ يظهر هنا ملف تعريف شطف اليود 125 المسمى أسيل جريلين في دم الإنسان بعد معالجة الدم القياسية أو السريعة.

بعد المعالجة السريعة ، استعصى اليود 125 المسمى جريلين في الموضع المتوقع. بينما بعد الإجراء القياسي ، لوحظت ذروة سابقة. من المحتمل أن يتوافق مع ديساسيل جريلين.

يمثل هذا تدهورا بنسبة 62٪ من الببتيد. تعمل معالجة الدم السريعة على تحسين نسبة الأسيل ، ديساسيل جريلين مقارنة بالمعالجة القياسية. بعد المعالجة السريعة ، كانت نسبة الأسيل ، ديساسيل جريلين في دم الأشخاص ذوي الوزن الطبيعي من واحد إلى ثلاثة.

مقارنة بواحد إلى 23 بعد معالجة الدم القياسية. لوحظت نتائج مماثلة في ظل ظروف فقدان الشهية والسمنة. تؤدي معالجة الدم السريعة إلى زيادة مستويات الكيسبتين الذاتية في الدم مقارنة بالمعالجة القياسية.

في كل من الأشخاص الذين يعانون من فقدان الشهية والوزن الطبيعي ، كانت مستويات الكيسبتين الداخلية المنتشرة أعلى بكثير بعد RAPID مقارنة بالمعالجة القياسية. لم يصل الاختلاف إلى أهمية في ظل ظروف السمنة. بمجرد إتقانها وتنفيذها بشكل صحيح ، يمكن القيام بهذه التقنية في أقل من ساعة واحدة.

هذه الطريقة مهمة بشكل خاص عندما يكون التركيز المتوقع للببتيد منخفضا ، أو تكون الاختلافات بين المجموعات صغيرة. لا يمكن تقديم توصية عامة للببتيدات. يجب اختبار الفائدة المحتملة لكل ببتيد مرة واحدة في البداية.

تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مختلف المجالات لاستكشاف المحصول والأهم من ذلك ، الشكل الجزيئي الصحيح لهرمونات الببتيد الذاتية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطبيق طريقة RAPID لمعالجة الدم لدى البشر.