غليكان تحليل عقدة: نهج من أسفل إلى أعلى لGlycomics

الهدف العام من هذا الإجراء هو تكسير جميع الجليكان في عينة بيولوجية مع الحفاظ على تكوين السكريات الأحادية ومعلومات الربط. تسهيل تقطير ميزات الجليكان المثيرة للاهتمام مثل التلوية المرضية وتقسيم N-Acetylglucosamine إلى إشارات تحليلية واحدة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة مباشرة على الأسئلة الرئيسية في مجال الجليكوميت مثل ميزات الجليكان الفريدة التي يتم تغييرها في حالات مرضية معينة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن ميزات الجليكان التي تميل إلى التغيير في الأمراض مثل تفرع بيتا 1-6 والصخرية يتم تقطيرها في إشارات تحليلية مفردة بدلا من نشرها عبر العديد من الجليكانات السليمة. بشكل عام ، يحتاج الأفراد إلى القيام بهذه الطريقة ، وتعاني حقا من الضعف في N-Acetylcysteines بسبب المعالجة غير السليمة للجليكان البيرميثوليد الطازج. قم بإعداد العينات ، عن طريق نقل تسعة لترات صغيرة من كل مادة تحليلية بيولوجية إلى أنابيب اختبار منفصلة سعة 1.5 ملليلتر.

أضف إلى كل عينة ميكرو لتر واحد من الماء منزوع الأيونات و 270 ميكرولترا من النقاء العالي من DMSO. واخلطها بقوة عن طريق دوامتها. بعد تحضير العينة ، قم بتجميع أعمدة الدوران المحملة بهيدروكسيد الصوديوم كما هو موضح في بروتوكول النص.

باستخدام حقنة تحليلية ، أضف 105 ميكرو لترات من اليودوميثان إلى كل مادة تحليلية وقم بتغطية الأنابيب على الفور. دوامة العينات بدقة. افصل أعمدة الدوران المعدة السابقة وقم بطردها لمدة 15 ثانية عند 2 ، 400 جيجابايت ، وبعد التخلص من أنابيب الخزان والأثرياء ، أعد توصيل الأعمدة وضعها داخل مجموعة جديدة من الأنابيب ، المسمى لكل مادة تحليلية.

استخدم رأس أنبوب سعة 1000 ميكرو لتر لنقل كل محلول تحليلي إلى عمود الدوران المقابل. بمجرد إضافة محلول التحليل ، قم بتجعيد حوالي ملليلترين من نهاية رأس الأنبوب سعة 200 لتر صغير واترك الطرف في العمود لاستخدامه كمحرك. استخدم أطراف رأس الأنبوب لتقليب الأعمدة برفق مرة واحدة من دقيقتين إلى ثلاث دقائق.

بعد 11 دقيقة ، افصل الأعمدة وقم بطردها لمدة 15 ثانية عند 2 ، 400 Gs.قم بإزالة أعمدة الدوران على الفور ووضعها في أنابيب خزان جديدة ، مما يوفر محلول التدفق مع التخلص من المقابس. إلى الأعمدة ، أضف 300 ميكرو لتر من الأسيتونينتريل وقم بطردها 30 ثانية عند 9 ، 600 Gs.الآن قم بنقل أول محاليل التدفق البيرميثالي إلى أنابيب اختبار زجاجية سيليان تحتوي على 3.5 مل من محلول فوسفات الصوديوم. تأكد من أن supernaned المنقول واضح وأنه لا يتم نقل أي مادة صلبة.

ستتشكل حبيبات بيضاء صغيرة في قاع الأنابيب البلاستيكية. تجنب نقل أي مادة صلبة واضحة. سيؤدي عدم القيام بذلك إلى ضعف غلة ملاحظات جليكان N-Acetylcysteine-glucosamine.

قم على الفور بدوامة كل عينة في الدفعة بمجرد نقل جميع العينات. ثم امزج محاليل تدفق الأسيتونينتريل مع باقي السائل في أنابيب الاختبار المعنية. مرة أخرى ، تجنب نقل أي بقايا بيضاء صلبة خلال هذه الخطوة.

قم بتغطية المحاليل المدمجة ورجها ودوامها مباشرة قبل الانتقال إلى العينة التالية. بعد البيريثيل ، أضف 1.2 مل من الكلوروفورم إلى كل أنبوب اختبار داخل غطاء الدخان. ثم قم بتغطية الأنابيب وخلط المحتويات بقوة.

لفصل الطبقات ، قم بالطرد المركزي للمحاليل لفترة وجيزة عند 3 ، 000 Gs.استخدم رأس أنبوب المراعي لاستخراج والتخلص من معظم الطبقة المائية العليا تاركا حوالي ثلاثة ملليلتر من الطبقة وراءه. أضف 3.5 مل من المخزن المؤقت لفوسفات الصوديوم 0.2 مولار ثم قم بتغطية أنبوب الاختبار وخلطه وتشغيله بالطرد المركزي. قم بتنفيذ خطوة استخراج السائل / السائل هذه ما مجموعه ثلاث مرات.

ترك حوالي ملليلتر واحد من الطبقة المائية في الاستخراج النهائي. استخدم الآن رأس أنبوب مراعي سيلاني نظيف لنقل طبقة الكلوروفورم بعناية إلى أنبوب اختبار زجاجي سيلاني نظيف ومصنف كما هو موضح في بروتوكول النص. في مشعب التبخر المسخن مسبقا ، مضبوطة على 75 درجة مئوية ، جفف العينات تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين.

تأكد من أن تدفق الغاز يزعج سطح السائل ولكن دون تناثره. بمجرد أن تجف العينات ، تصبح جاهزة للتحلل المائي. أضف 325 لترا صغيرا من 2 حمض خليك ثلاثي فلورو مولار أو TFA إلى كل عينة واخلطهم جيدا.

قم بتغطية كل أنبوب عينة بإحكام فور إضافته إلى جميع العينات لمنع تبخر TFA وفقدان العينة أثناء خطوة التسخين اللاحقة. احتضان العينات عند 121 درجة مئوية لمدة ساعتين لتحويل الجليكانات. أثناء احتضان العينات ، مرة أخرى ، قم بإعداد مشعب التبخر عند 75 درجة مئوية.

بعد الحضانة ، جفف العينات تحت تيار مستمر من النيتروجين في مشعب التبخر. تحقق بشكل متكرر من العينات للتأكد من تجفيفها باستخدام أقل قدر ممكن من وقت التجفيف. أضف إلى كل عينة 475 ميكرو لترا سعة 10 جرامات لكل لتر من بوروهيدريد الصوديوم.

ثم امزج العينات جيدا لإذابة أي بقايا. قم بتغطية أنابيب الاختبار واترك تفاعل الاختزال يستمر لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، أضف 63 لترا صغيرا من الميثانول إلى كل عينة.

امزج العينات ثم جففها عند 75 درجة مئوية تحت النيتروجين. أضف 125 لترا صغيرا من الميثانول إلى محلول حمض الأسيتيك لكل عينة. امزج العينات ثم جففها مرة أخرى عند 75 درجة مئوية تحت النيتروجين.

تأكد من جفاف العينات تماما عن طريق وضعها تحت فراغ لمدة 20 دقيقة. بعد التجفيف ، أضف 18 لترا صغيرا من الماء منزوع الأيونات إلى كل عينة. ثم قم بالطرد المركزي للعينات لفترة وجيزة واخلطها جيدا لإذابة الرواسب.

بعد ذلك ، أضف 250 لترا صغيرا من أنهيدريد الخليك إلى كل أنبوب. قم بتغطية الأنابيب ، وقم بدوامة العينات جيدا وصوتنة العينات في حمام مائي لمدة دقيقتين لضمان الذوبان الكامل لأي بقايا. ثم احتضان العينات عند 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

أضف الآن 230 لترا صغيرا من TFA المركز إلى كل عينة. بعد تغطية العينات وخلطها ، احتضنها لمدة 10 دقائق بدرجة حرارة داخلية تبلغ 50 درجة مئوية. أضف 1.8 مل من ثنائي كلورو الميثان إلى كل عينة واخلط جيدا.

بعد ذلك ، أضف ملليلترين من الماء الأيوني إلى الأنبوب وقم بإجراء استخراج السائل / السائل مرتين. استرجع طبقة ثنائي كلورو الميثان برأس أنبوب مراعي سيلاني. انقله إلى قارورة أخذ العينات التلقائية ثم جفف العينة تحت النيتروجين عند 74 درجة مئوية.

قبل GC-MS ، أعد تكوين العينات التي تحتوي كل منها على 120 لترا صغيرا من الأسيتون ، وقم بتغطيتها وخلطها جيدا. في وضع الانقسام ، استخدم جهاز أخذ العينات التلقائي لحقن ميكرو لتر واحد من كل عينة في بطانة وضع الانقسام GC. بالنسبة لمطياف كتلة وقت الرحلة ، يوصى بتقسيم حصة من أربعين وغاز الهيليوم في وضع التدفق المستمر عند 0.8 مل في الدقيقة.

قم بتحليل العينة باستخدام تدرج من خطوتين يصل إلى 325 درجة مئوية. أخضع مكونات العينة المراوغة لتأين الإلكترون. بالنسبة لوقت محلل كتلة الطيران ، قم بتحليل الأجزاء M فوق Z 40 إلى 800 بمعدل جمع نبض 0.1 ثانية.

لإثبات حساسية هذا البروتوكول ، تمت معالجة عينة بيولوجية بعناية. يعطي الكروماتوغرام الناتج كثافة كافية بين قمم المنتج المطلوبة لسهولة المقارنة والتحليل. ثم تمت معالجة نفس العينة البيولوجية الأولية بنفس الإجراء.

لكن البقايا البيضاء في محلول بيرميثيل التي تم نسجها من خلال عمود NAOH تم نقلها إلى الخليط اللاحق لاستخراج السائل / السائل. يعطي الكروماتوجرام نسبة مختلفة من كثافة الذروة لنفس منتجات العينة الرئيسية. عند مقارنتها مباشرة ، يكون الفرق صارخا.

يعد الاكتئاب الواضح لذروة N-acetylglucosamine المرتبطة ب 4 مواضع في الكروماتوجرام الثاني سمة يمكن التعرف عليها لتخليص البيريثيل والاستخراج غير الناجح. لتقدير فائدة هذا النهج في الكشف عن الاختلافات في تكوين الجليكان في حالات المرض ، يتم تطبيع الكروماتوغرامات الأيونية المستخرجة من عينة بلازما الدم الطبيعية وعينة بلازما دم مريض السرطان من أجل مانوس 2 مرتبط وتراكب. الاختلافات الكمية في ميزات الجليكان الفريدة مثل تفرع بيتا 1-6 وكذلك التواتر المريضة واضحة بسهولة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تحليل العقدة الجليكومية من أسفل إلى أعلى. تسهيل تقطير ميزات الجليكان المثيرة للاهتمام مثل الكورفولكوزالية ، والاستزراب المرضي ، وتقسيم الجليكانيت إلى إشارات تحليلية واحدة.