Name: الإدارة داخل القصبة الهوائية لل المستدمية النزلية في نماذج الماوس لدراسة التهاب الشعب الهوائية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: تعلم تقنية الإداج داخل القصبة الهوائية لدراسة الاستجابات المناعية في الرئة أثناء العدوى البكتيرية باستخدام نماذج الفئران. هذه الطريقة فعّالة وقابلة للتكرار عالية لاستكشاف آليات التهاب الشعب الهوائية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر الدكتور كارسون هارود على القراءة النقدية للمخطوطة. كما نشكر السيد مينغوي تسنغ والدكتورين ماهيش كاثانيا وبراشانت كهاري على مساهماتهم. تم دعم هذا العمل من خلال منح من جمعية السرطان الأمريكية (منحة الباحث ، 122713-RSG-12-260-01-LIB) ومركز سامونز للسرطان (منحة المشروع التجريبي) إلى K. Venuprasad.

أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من معهد بحوث بايلور. 1. التثقيف غير typeable المستدمية النزلية (NTHi) وإعداد اللقاح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة NTHi على لوحة أجار الشوكولاته والحفاظ على لوحة رأسا على عقب في ترطيب CO 2 حاضنة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و CO 2 5٪. اليوم، ثقافة التالية البكتيريا في مرق الدماغ القلب ضخ. ثم، إضافة 1 مل من مرق في أنبوب 1.5 مل العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه في 1 مل العقيمة برنامج تلفزيوني 1X. كرر هذه الخطوة مرة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 100 ميكرولتر من إعادة علقت الحل في 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X وقياس الامتصاصية للثقافة المخفف في 600 نانومتر الطول الموجي في معمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد وحدة سلامة وتشكيل مستعمرةالصورة (CFUs) من اللقاح عن طريق زراعة 01:10 التخفيفات المسلسل على لوحات الشوكولاته أجار وتفرخ بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبناء على جدوى وCFUs تحديد من الخطوة السابقة، وضبط اللقاح إلى تركيز النهائي من 20 × 10 6 خلية / مل. </li></ol> 2. الناشبة داخل القصبة الهوائية (عليه) تقطير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن فأر داخل الصفاق (IP) مع 0.1 مل / 10 غرام من وزن الجسم من الفأر مع 150 ملغ / مل الكيتامين + 20 ملغ / مل حل زيلازين. وينبغي أن يتم هذا الإجراء في غطاء محرك السيارة مع مصدر الضوء للحفاظ على الحارة الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قرصة الفضاء بين الأصابع من الفأرة للتحقق من أن الفأر هو تخدير كاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على ظهرها. حلاقة المنطقة البطنية من الرقبة وتعقيم مع الكلورهيكسيدين و 70٪ الكحول الإيثيلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الجلد من الجزء البطني العلوي من الرقبة باستخدام ملقط الأسنان الفئران. إجراء شق صغير (0،5-1،0 سم) فوق الغدة الصعترية باستخدام مشرطوتشريح بعناية العضلات لفضح القصبة الهوائية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 27 G، وضخ ببطء 0.05 مل الهواء، تليها 0.05 مل NTHi تم الحصول عليها من القسم 1 أو المالحة كعنصر تحكم، تليها جوية أخرى 0.05 مل. إبقاء الحيوانات الرأسي لحوالي 1 دقيقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق شق مع الغراء الجراحية. الحفاظ على الماوس راقد أفقيا ودافئة لمدة 10 دقيقة. </li></ol> 3. BALF مجموعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الماوس عن طريق عنق الرحم التفكك 24 ساعة بعد الإصابة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح تجويف البطن من الفأرة مع مقص التشريحية وقطع الشريان الأورطي البطني ينزف. كشف الجزء البطني من الرئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح القصبة الهوائية وتدخله مع قسطرة قياس 20. غرس 0.8 مل من العازلة BALF (برنامج تلفزيوني 1X، 0.1٪ سكر العنب، 10 U / مل الهيبارين) وجمع غسيل من قبل التطلع لطيف. كرر هذا الإجراء ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد العدد الكلي للخلايا في 100 ميكرولتر من تعليق BALF باستخدام hemocytoمتر تحت التكبير 10X مع تلطيخ التريبان الأزرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الشرائح لتعديل تلطيخ بالغيمزا. قسامة 100 ميكرولتر من BALF في الآبار الملائمة للcytospin وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق. تجفيف الشرائح لمدة 10 دقيقة وصمة عار على الخلايا باستخدام تعديل بالغيمزا صمة عار وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الخلايا المتبقية لتحليلها لاحقا، مثل تنوير خلية تنشيط الفرز (FACS)، الفحص المجهري متحد البؤر، التعبير الجيني وصمة عار الغربية 11-13. </li></ol> 4. إعداد التشريح المرضي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل أمراض الأنسجة، ويصيب الفئران مع NTHi كما هو موضح في الخطوة 2.4. بعد 24 ساعة من العدوى، والتضحية الحيوانات عن طريق التفكك عنق الرحم. خفض فتح التجويف الصدري مع مقص التشريحية لفضح الرئتين والقصبة الهوائية كما ذكر من قبل. ثم، تضاف قسطرة قياس 20 إلى القصبة الهوائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الرئة مع 2٪ محلول الاغاروز دافئ أعد في 4٪ من الفورمالين. مرة واحدة فيوتضخم الرئتين تماما، مكان الثلج على قمة الرئتين لترسيخ الحل الاغاروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم، وإزالة بعناية المكونات الصدري ووضعها في محلول 50 مل من 4٪ من الفورمالين في برنامج تلفزيوني 1X حتى تتم معالجتها لالهيماتوكسيلين ويوزين (H &amp; E) أقسام. </li></ol> 5. FACS تلطيخ الخلايا في BALF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 1 × 10 5 خلايا من السائل BALF في 96-جيدا لوحة عيار الصغيرة-V السفلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 300 ميكرولتر من البرد برنامج تلفزيوني 1X وتدور في 4000 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على الخلايا مع حل الخلية وصمة عار في 100 1X ميكرولتر PBS (1: 1000 تمييع) والحفاظ على درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 300 ميكرولتر من البرد برنامج تلفزيوني 1X في 4000 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء الخلايا في 100 ميكرولتر من العازلة FACS غسل [غسل العازلة (برنامج تلفزيوني 1X، 2٪ FBS، 1 ملم EDTA، 0.1٪ أزيد الصوديوم] التي تحتوي على 1: 100 المخفف FC-بلوك لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 3 دقائق وتجاهل سوبernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا وصمة عار مع 100 ميكرولتر تلطيخ السطح كوكتيل (1: 100 تمييع) في غسل العازلة FACS لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا ثلاث مرات مع 300 ميكرولتر من غسل العازلة FACS في 4000 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا في 100 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين مع 300 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X في 400 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية واعادة تعليق في 300 ميكرولتر من غسل العازلة FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الضوابط تلطيخ أحادية اللون باستخدام التدفق الخلوي الخرز. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة واحدة من الخرز في 96-جيدا لوحة ميكروليتر-V القاع، ويغسل مع 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة تلطيخ إلى 100 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X والخرز واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات مرتين مع 300 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الضوابط واحدة الملطخة والخلايا عن طريق التدفق الخلوي 14. </li></ol> 6. التجانس من أنسجة الرئة لعزل الحمض النووي الريبي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الإصابة، وجمع قطعة صغيرة من الرئة (20-40 ملغ) وابقائه في الحمض النووي الريبي استقرار الكاشف في 4 درجات مئوية خلال الليل. ثم، واحفظها في -80 درجة مئوية حتى الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأنسجة الرئوية في البرد برنامج تلفزيوني 1X للتخلص من كاشف استقرار الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأنسجة في 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على تحلل العازلة (1 مل تحلل عازلة + 10 ميكرولتر β-المركابتويثانول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم الأنسجة الى قطع صغيرة باستخدام مقص وأشار والتجانس باستخدام اللاسلكية مدقة بيليه السيارات ل20-40 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء المحللة على الجليد لمدة 5 دقائق والمضي قدما في الخطوة 7.1. </li></ol> 7. عزل الحمض النووي الريبي من الرئة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي المحللة في 18000 x ج لمدة 3 دقائق. إزالة طاف قبل pipetting ونقل بعناية لأنبوب 1.5 مل جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى حجم 1 من 70٪ من الإيثانول لالمحللة. مزيج فورا من قبل pipetting والانتظار لمدة 2-4 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ما يصل إلى 700 ميكرولتر من المحللة لعمود الدوران وضعتفي أنبوب جمع 2 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 9600 x ج لمدة 15 ثانية، وتجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 350 ميكرولتر غسل العازلة صرامة وأجهزة الطرد المركزي في 9600 x ج لمدة 15 ثانية. تجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 80 ميكرولتر الدناز أنا مباشرة لغشاء عمود الدوران والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 350 ميكرولتر غسل العازلة صرامة لعمود الدوران والطرد المركزي في 9600 x ج لمدة 15 ثانية. تجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر غسل العازلة RNA وأجهزة الطرد المركزي في 9600 x ج لمدة 15 ثانية. تجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر غسل العازلة RNA وتدور في 9600 x ج لمدة 2 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع عمود الدوران في أنبوب جديد لجمع 2 مل وأجهزة الطرد المركزي في 9600 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 30-50 المياه خالية من ريبونوكلياز ميكرولتر مباشرة إلى عمود الدوران والطرد المركزي في 9600 x ج لمدة 1 دقيقة. تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل RNAseq 14. </li></ol>

<ol><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+physiological+roles+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and physiological roles of inflammation.</a> Nature. 454, 428-435 (2008).</li>
<li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+inflammation%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140, 883-899 (2010).</li>
<li>Barnes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+asthma+and+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease.</a> Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).</li>
<li>Sethi, S., Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+in+the+pathogenesis+and+course+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease.</a> N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).</li>
<li>King, P. T., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lung+Immune+Response+to+Nontypeable+Haemophilus+influenzae+%28Lung+Immunity+to+NTHi%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi).</a> J Immunol Res. 2015, 706376(2015).</li>
<li>Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+airway+microbiology+and+cellularity+in+children+with+newly+diagnosed+non-CF+bronchiectasis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis.</a> Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).</li>
<li>King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+PT+%22Respir+Med%22">Respir Med</a>. 101, 1633-1638 (2007).</li>
<li>Shuto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+NF-kappa+B+by+nontypeable+Hemophilus+influenzae+is+mediated+by+toll-like+receptor+2-TAK1-dependent+NIK-IKK+alpha+%2Fbeta-I+kappa+B+alpha+and+MKK3%2F6-p38+MAP+kinase+signaling+pathways+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).</li>
<li>Moghaddam, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemophilus+influenzae+lysate+induces+aspects+of+the+chronic+obstructive+pulmonary+disease+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).</li>
<li>Rajagopalan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+exposure+to+bacterial+superantigens+induces+airway+inflammation+in+HLA+class+II+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice.</a> Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).</li>
<li>Ganesan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastase%2FLPS-exposed+mice+exhibit+impaired+innate+immune+responses+to+bacterial+challenge%3A+role+of+scavenger+receptor+A%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A.</a> Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).</li>
<li>Hogner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-expressed+IFN-beta+contributes+to+apoptotic+alveolar+epithelial+cell+injury+in+severe+influenza+virus+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia.</a> PLoS Pathog. 9, e1003188(2013).</li>
<li>Karisola, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+Natural+Killer+T+Cells+Play+a+Role+in+Chemotaxis%2C+Complement+Activation+and+Mucus+Production+in+a+Mouse+Model+of+Airway+Hyperreactivity+and+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation.</a> PloS one. 10, e0129446(2015).</li>
<li>Theivanthiran, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E3+ubiquitin+ligase+Itch+inhibits+p38alpha+signaling+and+skin+inflammation+through+the+ubiquitylation+of+Tab1%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1.</a> Sci Signal. 8, 22(2015).</li>
<li>Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+role+of+the+ubiquitin+ligase+Itch+in+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation.</a> Immunol Cell Biol. , (2015).</li>
<li>Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Chronic obstructive pulmonary disease.</a> Lancet. 379, 1341-1351 (2012).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

هنا، نحن تصف الإجراء الفريد والغازية الحد الأدنى لتطعيم الرئتين من الفئران مع العوامل المسببة للأمراض الرئة البكتيري. علينا أن نظهر أن هذا الإجراء يمكن أن تستخدم لدراسة وظيفة الجينات المختلفة باستخدام الفئران التي تعاني من نقص في الجينات من مسارات الإشارات التهابات. ويمكن أيضا أن هذا الإجراء يمكن استخدامها لدراسة الاستجابات الالتهابية للعدوى الرئة الفيروسية والفطرية. و(1) في هذا الإجراء، يتم غرس مزايا هذا الإجراء عبر وسائل أخرى مثل الأنف أو استنشاق الهباء الجوي اللقاح المسببة للأم...

التهاب هو الآلية المناعية الأساسية للدفاع ضد العوامل المعدية. وهي تشجع القضاء على مسببات المرض وإصلاح الأنسجة التالفة. كما أنها تسهل عملية الانتعاش إلى حالة صحية طبيعية 1. ومع ذلك، والتهاب dysregulated غالبا ما يؤدي إلى الأمراض الالتهابية المزمنة 2. التهاب الشعب الهوائية هو السبب المبدئي للأمراض الرئوية مختلفة مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، الربو وتليف رئوي 3. ويرتبط عدم typeable (unencapsulated) المستدمية النزلية (NTHi) مع الأمراض الالتهابية العلوية والسفلية الرئة المزمنة 4،5. ومن الأنواع السائدة معزولة عن الشعب الهوائية أقل من الأطفال والبالغين الذين يعانون من الانسداد 4،6،7 أمراض الرئة المزمنة. وتتميز الاستجابة الالتهابية بعد الإصابة NTHi قبل upregulation من السيتوكينات proinflammatory (مثل TNF و IL-1β)، وتوسط ذلك بذ mitogen البروتين كيناز تفعيلها (MAPK) والنووي عامل كيلوبايت (NF كيلوبايت) من خلال مستقبلات تول مثل (TLRs) 8. نماذج الماوس أدوات مفيدة جدا لتحليل الأمراض الكامنة وراء مرض التهاب الرئة بسبب توافر خطوط الجينات ناقصة مختلفة. وقد استخدمت عدة طرق لتطعيم البكتيريا الحية / الموهن والمنتجات البكتيرية، بما في ذلك تقطير الأنف ورذاذ 9،10 الاستنشاق. هنا، علينا أن نظهر داخل القصبة الهوائية تقطير. على الرغم من أن أقل استخداما، وهذا النهج هو أكثر كفاءة وتكرار للغاية نظرا للتسليم المباشر من اللقاح في الجهاز التنفسي السفلي.

<table><tbody><tr><td>لوحة أجار الشوكولاته</td><td>فيشر Scientific</td><td>CAS50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>سكر العنب اللامائي</td><td>Themo Scientific</td><td>R01300</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Hospira، Inc</td><td>RL-3010</td><td></td></tr><tr><td>الحل السريع الماهر</td><td>Sigma</td><td>GS500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>إبرة حقنة 20/26G & nbsp ؛</td><td>دينار بحريني</td> <td>(REF305115/175)</td><td></td></tr> <tr><td>حقنة Iml</td><td>BD</td><td>REF 309602</td><td></td></tr><tr><td>قسطرة 20GA</td><td>BD</td><td>REF</td><td></td></tr> 381433 <tr><td>مقص تشريح ، مستقيم ، بطول 10 سم</td><td>ملقط كينت ساينتسايكل</td><td>INS600393</td><td></td></tr><tr><td>القزحية ، مسنن ، بطول 10 سم</td><td>ملاقط INS650915</td><td></td><td></td>kentscientific</tr><tr><td># 5 ستانلس ستيل ، بطول 11 سم</td><td>kentscientific</td><td>INS600095</td><td></td></tr><tr><td>10٪ فورمالين</td><td>فيشر Scientific</td><td>CAS 67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>5 مل أنابيب البوليسترين المستديرة القاع BD</td><td></td><td>REF 352058</td><td></td></tr><tr><td>1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة Light</td><td>Labs</td><td>A-7001-R</td><td></td></tr><tr><td>Reasy Mini &nbsp; kit &nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>بيليه المحرك الحشري (مجانس الأنسجة)</td><td>Sigma</td><td>Z359971-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96 بئر لوحات microtiter V أسفل</td><td>Thermo</td><td>2605</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0454-81</td> تخفيف <td>العمل 1:100</td></tr><tr><td>Ly-6G-eFlor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>تخفيف العمل 1:100</td></tr><tr><td>BSA</td><td>HyClone</td><td>SH30574.03</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer (10X)</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr> Live <tr><td>/ Dead قابلة للإصلاح طقم بقع الخلايا الميتة المائية</td><td>Invitrogen</td><td>L-34957</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5M)</td> <td>lifetechnologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>CD16 / CD32 FcBlock</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Facs أنابيب البوليسترين أنبوب القاع المستدير</td><td>BD</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>الفورمالديهايد</td><td>Polyscience</td><td>4018</td><td></td></tr></tbody></table>

الإدارة داخل القصبة الهوائية لل<em&gt; المستدمية النزلية</em&gt; في نماذج الماوس لدراسة التهاب الشعب الهوائية

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

هنا، نحن تصف إجراءات تفصيلية لكفاءة وتسليم مباشرة المستدمية النزلية في المجاري التنفسية السفلى من الفئران. ونحن لشرح إجراءات إعداد ه. النزلية اللقاح، تقطير داخل القصبة الهوائية من H. النزلية في الرئة، وجمع السائل النزلة السنخ غسيل (BALF)، وتحليل الخلايا المناعية في BALF، وعزل الحمض النووي الريبي لتحليل التعبير الجيني المغاير. هذا الإجراء يمكن استخدامها لدراسة استجابة الرئة الالتهابية إلى أي بكتيريا، أو فيروس الفطريات. ويفضل القصبة الهوائية تقطير المباشر في الغالب على إجراءات الأنف أو استنشاق الهباء الجوي لأنها توفر أكثر كفاءة اللقاح البكتيري في الجهاز التنفسي السفلي مع أقل الغموض.

أدى تقطير داخل القصبة الهوائية في العدد المتزايد بشكل ملحوظ من الكريات البيض في BALF (الشكل 1A، غادر لوحة) من تركيب بمحلول ملحي. أظهر تحليل العد التفريقي لكريات الدم البيضاء وبوضوح زيادة تسلل العدلات (الشكل 1، اللوحة اليمنى). تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية من الخلايا في BALF أكد كذلك زيادة عدد العدلات (الشكل 1B). التحليل النسيجي للأقسام H &amp; E الملون في أنسجة الرئة أظهرت زيادة التهاب الشعب ا...

نعرض إجراء التلقيح داخل القصبة الهوائية للمستدمية النزلية في الجهاز التنفسي السفلي للفئران. هذه أداة مفيدة للغاية لدراسة مسارات الإشارات التي تنظم التهاب مجرى الهواء في نماذج الفئران.

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

الهدف العام من هذه التجربة هو دراسة الاستجابات المناعية في الرئة أثناء العدوى البكتيرية. ويمكن أن يساعد هذا الأمر في الإجابة على بعض الأسئلة الرئيسية في مجال التهاب الرئة، مثل ما هي الآليات والجينات التنظيمية الرئيسية التي تثبط أو تعزز التهاب الرئة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في كونها فعالة للغاية وقابلة للتكرار بدقة عالية بسبب التوصيل المباشر للقاح البكتيري إلى الجهاز التنفسي السفلي.للبدء، يتم استزراع NTHi على طبق آجار شوكولاتة. يُحضن الطبق مقلوباً طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون. وفي اليوم التالي، تُستزرع البكتيريا في مرق تسريب الدماغ والقلب.ثم، في أنبوب طرد مركزي دقيق، أضف 1 mL من المرق. قم بتدوير الخليط عند 4,000 g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، تخلص من الطافي وأعد تعليق الراسب في 1 mL من PBS.كرر خطوة الغسيل هذه مرة أخرى. بعد ذلك، خفف 100 µL من المحلول المعاد تعليقه في 900 µL من PBS، وقم بقياس امتصاص المزرعة عند 600 nm. استخدم هذه المعلومات لضبط اللقاح ليصل إلى 20 مليون CFU لكل mL.بعد ذلك، يتم تحديد الحيوية ووحدات تشكيل المستعمرات (CFUs) للّقاح. يتم استزراع تخفيفات تسلسلية من واحد إلى عشرة من المرق على أطباق آغار الشوكولاتة، وتحضين الأطباق طوال الليل. ابدأ بتخدير الفأر، والتحقق من تخديره بشكل كافٍ باستخدام اختبار قرصة إصبع القدم.بعد ذلك، ضع الفأر في وضعية الاستلقاء على الظهر واحلق المنطقة البطنية من الرقبة. قم بتطهير الجلد المكشوف. الآن، ارفع الجلد من الجزء البطني العلوي للرقبة باستخدام ملقط أسنان الجرذان، وباستخدام المشرط، قم بعمل شق بطول نصف إلى واحد سنتيمتر فوق الغدة الزعترية.ثم قم بفصل العضلة بعناية للكشف عن الرغامي. وفي الرغامي، احقن ببطء 50 µL من الهواء، يتبعها 50 µL من NTHi المُحضّر، ثم 50 µL أخرى من الهواء. وبالنسبة لإجراء الضبط السلبي، يتم حقن المحلول الملحي بدلاً من NTHi.بعد الحقن، حافظ على وضعية الحيوان عمودياً لمدة دقيقة تقريباً. ثم أغلق الشق باستخدام لاصق الأنسجة وحافظ على بقاء الفأر في وضع الاستلقاء الجانبي ودافئاً لمدة 10 دقائق تقريباً. بعد 24 ساعة من العدوى، قم بقصوت الحيوان المصاب وافتح التجويف البطني باستخدام مقص تشريحي.بعد ذلك، يتم قطع الأبهر البطني لنزف الحيوان. تلى ذلك كشف الجزء البطني من الرئة للوصول إلى الرغامي. يتم إجراء تنبيب للرغامي باستخدام قسطرة قياس 20.باستخدام القسطرة، يتم حقن 0.8 milliliters من منظم BALF وجمع سائل الغسيل عن طريق الشفط السني. كرر هذا الإجراء ثلاث مرات إضافية، مع تجميع عينات الغسيل الأربع في معلق واحد. خذ عينة حجمها 100 microliter وقم بطردها مركزياً لمدة دقيقتين بسرعة 2,000 RPM.قم بإزالة السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في محلول تحلل كرات الدم الحمراء (RBC lysis buffer). قم بالطرد المركزي ثم أعد تعليق الراسب باستخدام 1x PBS. الآن، قم بعدّ العدد الإجمالي للخلايا في 100 µL من المعلق باستخدام مقياس خلايا الدم (hemocytometer) تحت تكبير 10x مع الصبغ بصبغة تريبان الزرقاء (trypan blue).بعد ذلك، قم بتحضير الشرائح لصبغ الخلايا. وزع 100 µL من معلق BALF في الآبار المناسبة لشرائح cytospin، وقم بتدوير الشرائح عند 500 g لمدة خمس دقائق. ثم جفف الشرائح لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، واصبغ الخلايا باستخدام صبغة Giemsa المعدلة وفقاً لبروتوكولات الشركة المصنعة.استخدم الخلايا المتبقية للتحليلات اللاحقة، مثل قياس التدفق الخلوي (FACS)، والمجهر البؤري، وما إلى ذلك. بعد جمع سائل الغسيل من الرئة المصابة، خذ قطعة من الرئة تزن 20-40 milligram واحضنها في كاشف تثبيت RNA عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل، يليه تخزين طويل الأمد عند درجة حرارة 80- °C. وعندما تكون مستعداً، اغسل عينات أنسجة الرئة في PBS بارد لإزالة كاشف تثبيت RNA.بعد ذلك، ضع النسيج في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 milliliter يحتوي على محلول تحلل خلوي (lysis buffer) مع beta mercaptoethanol. تالياً، قم بتقطيع النسيج إلى قطع صغيرة باستخدام مقص صغير، ثم قم بتجنيس القطع باستخدام مدقة آلية لمدة 20-40 ثانية. احفظ ناتج التحلل على الثلج لمدة خمس دقائق، ثم قم بطرده مركزياً بسرعة 18, 000 g's لمدة ثلاث دقائق.أزل السائل الطافي بعناية وانقله إلى أنبوب جديد. ثم أضف حجماً مساوياً من 70% ethanol وقم بتجانس الخليط عن طريق التفتيت. اترك الخليط ليرتاح عند 25 درجة مئوية لمدة تتراوح بين دقيقتين إلى أربع دقائق.بعد ذلك، انقل ما يصل إلى 700 µL إلى عمود طرد مركزي مثبت على أنبوب تجميع سعة 2 mL، ثم قم بإجراء الطرد المركزي للعمود عند 9600 g لمدة 15 ثانية. تخلص من السائل المترشح، وأضف 350 µL من محلول الغسيل وكرر عملية الطرد المركزي. بعد ذلك، قم بتحضين الغشاء مع 80 µL من محلول DNase I لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك، أضف 350 µL من محلول الغسل إلى العمود وكرر عملية الطرد المركزي. ثم، أضف 500 µL من محلول غسل الـ RNA. كرر عملية الطرد المركزي القصيرة، وتخلص من السائل المار.قم بإجراء غسلتين باستخدام محلول غسيل RNA. وأخيراً، وضع أنبوب تجميع جديد، أضف من 30-50 µL من الماء الخالي من RNase مباشرة إلى العمود وقم بتدويره لمدة دقيقة واحدة لتجميع عينة RNA في السائل المار. تم تنفيذ هذا الإجراء كما هو موصوف مع فئران سليمة وطبيعية.أدى التثبيت داخل الرغامي إلى زيادة ملحوظة في عدد الكريات البيضاء في سائل غسيل القصبات والأسناخ لدى الفئران التي حُقنت بـ NTHi مقارنة بمجموعات الضبط التي عولجت بالمحلول الملحي. ويظهر تحليل العد التفريقي للكريات البيضاء بوضوح زيادة في ارتشاح الخلايا المتعادلة. كما يؤكد تحليل FACS للخلايا في سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) زيادة عدد الخلايا المتعادلة.تظهر المقاطع المصبوغة بـ HNE لأنسجة الرئة زيادة في التهاب المجاري التنفسية. وبشكل جماعي، تشير هذه البيانات إلى أن التثبيت الرغامي يحفز التهاب المجاري التنفسية في الفئران. وفي تجربة مماثلة أجريت على فئران طافرة وفئران ضابطة، تم تحليل الحمض النووي الريبي RNA لأنسجة الرئة عن طريق تسلسل الترانسكريبتوم الكامل.مقارنةً بمجموعات الضبط من النوع البري، أدى نقص Itch إلى تعبير تفاضلي لعدة جينات. ويُعتقد أن Itch يعمل كمنظم لمسارات التأشير الالتهابية، لذا يمكن استخدام هذه النتيجة لتعزيز دراسات جديدة. ومن خلال تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أمراض الرئة لاستكشاف التأشير الخلوي في الخلايا المناعية أثناء عدوى الرئة والالتهابات.عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر اتخاذ احتياطات إضافية أثناء خطوات مثل كشف الرغامي وزرع البكتيريا في الرغامي. وبمجرد إتقان هذه الطريقة، يمكن إجراء التلقيح الرغامي في غضون عشر دقائق، وجمع السائل من القنينة في غضون 10-15 دقيقة. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ عمليات إضافية مثل تسلسل RNA، وقياس التدفق الخلوي، والحجب المناعي للإجابة على تساؤلات إضافية مثل تحديد الجينات التي تم تحفيز تعبيرها أو تثبيطه.

intra-tracheal-administration-haemophilus-influenzae-mouse-models-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

المصدر: Venuprasad, K., et al. إعطاء المستدمية النزلية داخل القصبة الهوائية في نماذج الفئران لدراسة التهاب مجرى الهواء. J. Vis. خبرة. (2016)يوضح هذا الفيديو التوصيل داخل القصبة الهوائية للقاح بكتيري ممرض للرئة إلى فأر مخدر لنمذجة عدوى الجهاز التنفسي السفلي.

إجراء توصيل البكتيريا داخل القصبة الهوائية في نموذج الفأر

المصدر: Venuprasad, K., et al. إعطاء المستدمية النزلية داخل القصبة الهوائية في نماذج الفئران لدراسة التهاب مجرى الهواء. J. Vis. خبرة. (2016)يوضح هذا الفيديو جمع ومعالجة سائل الغسيل القصبي السنخي من فأر تم القتل الرحيم مصاب بالمستدمية النزلية غير القابلة للكتابة لتحليلها النهائي.

مجموعة سوائل الغسيل القصبية السنخية من نموذج فأر مصاب بالمستدمية النزلية غير القابلة للكتابة

المصدر: لينهارد، أ. وآخرون. نموذج الفأر لانتقال المكورات الرئوية العقدية من مستعمرة إلى ممرض عند العدوى الفيروسية المشتركة يعيد المرض المتفاقم بسبب التقدم في العمر. J. Vis. Exp. (2022)يوضح هذا الفيديو نموذج عدوى مشتركة للفأر حيث يؤدي فيروس الإنفلونزا إلى انتقال المكورات الرئوية العقدية من مستعمرة إلى مسبب مرض. يوضح الخطوات المتضمنة في استعمار البكتيريا، والعدوى الفيروسية، وتطور الأمراض.

نموذج فأر لدراسة الانتقال الممرضي لمجمع المكورات الرئوية بعد العدوى الفيروسية المشتركة

وقد وضعنا طريقة بسيطة وموثوق بها، وغير مكلفة نسبيا لالتنبيب الرغامي في الفئران عن طريق تنظير الحنجرة المباشر باستخدام منظار الأذن مع 2.0 مم المنظار. هذا الأسلوب هو ارضحي، ويمكن استخدامها لقياس المتكررة في التجارب المزمنة. نجد أنها متفوقة على القصبة الهوائية أو سبق وذكرت التقنيات غير الجراحية.

التنبيب الرغامي في الفئران<em&gt; عبر</em&gt; تنظير الحنجرة المباشر باستخدام منظار الأذن

استجابة المضيف المناعية للإصابة الممرض هو عملية تنظيم محكم. الاستفادة من وجود عديد السكاريد الشحمي الرئة نموذج التعرض في الفئران، وأنه من الممكن إجراء تقييمات عالية الدقة من الآليات المعقدة المرتبطة المرضية المرض.

والاستفادة من البلعوم الإدارة داخل القصبة الهوائية والقصبات PAMP الغسل لتقييم استجابة المضيف المناعية في الفئران

التنبيب داخل الرغامى بوساطة (IMIT) تقطير الكواشف هو، طريقة ممتازة موسع لدراسة أمراض الجهاز التنفسي، وكذلك وسيلة لغرس الكواشف العلاجية مباشرة في الرئة. انها طريقة سريعة وقابلة للتكرار للغاية والتي هي مناسبة لاختبار قبل السريرية.

بوساطة التنبيب داخل الرغامى (IMIT) تقطير: وموسع والرئة محدد نظام تسليم

هناك نقص عام في المعرفة حول كيفية عمل اللقاحات. نقترح هنا الاستخدام المشترك لعلم الوراثة العكسي والفئران الخيمرية لنخاع العظام لاكتساب نظرة ثاقبة للاستجابات المناعية المبكرة للمضيف للقاحات مع التركيز بشكل خاص على الخلايا المتغصنة ومناعة الخلايا التائية.

إدارة الأنف المؤتلف لقاحات الأنفلونزا في همي ماوس نماذج لدراسة الأغشية المخاطية الحصانة

وقد وصفت العديد من الطرق في الأدب لنمذجة الالتهاب الرئوي الجرثومي في الفئران. هنا، نحن تصف غير الغازية، وغير مكلفة، طريقة سريعة لإحداث الالتهاب الرئوي عن طريق الطموح (أي استنشاق) من اللقاح البكتيري pipetted في البلعوم. طرق المصب لتقييم الاستجابة المناعية الفطرية الرئوية هي أيضا مفصلة.

والطريقة غير الغازية ومن الناحية الفنية غير كثيفة للتحريض وPhenotyping التجريبية البكتيرية والالتهاب الرئوي في الفئران

في هذه الدراسة، نقدم بروتوكولا لأداء اثنين-فوتون إينترافيتال التصوير وخلية تحليل التفاعل في الغشاء المخاطي الرغامى مورين بعد الإصابة بفيروس الإنفلونزا. سوف يكون هذا البروتوكول ذات الصلة للباحثين دراسة ديناميات الخلايا المناعية أثناء التهابات الجهاز التنفسي.

تصوير تفاعل الخلية في الغشاء المخاطي الرغامى أثناء عدوى فيروس الإنفلونزا باستخدام الفحص المجهري إينترافيتال اثنين-فوتون

هنا نقدم بروتوكولا أنيقة في فيفو التقييم للقاح الاستجابات المناعية فعالية والمضيف. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لنماذج اللقاح تلك الدراسة الفيروسية، البكتيرية، أو مسببات الأمراض الطفيلية.

تقييم استجابات المضيف الممرض ونجاعة اللقاح في الفئران

يوفر هذا البروتوكول تعليمات للإعطاء داخل الأنف ل IAV والتحليل النهائي لتلف رئة الفأر والتغيرات النسخية المرتبطة به لأنواع خلايا الرئة.

نمذجة خلل التنسج وإصلاح السنخية الرئوية الوظيفية بعد الإصابة بالإنفلونزا

تعلم تقنية الإداج داخل القصبة الهوائية لدراسة الاستجابات المناعية في الرئة أثناء العدوى البكتيرية باستخدام نماذج الفئران. هذه الطريقة فعّالة وقابلة للتكرار عالية لاستكشاف آليات التهاب الشعب الهوائية.

الإدارة داخل القصبة الهوائية لل

استكشف المزيد من الفيديوهات