الإدارة داخل القصبة الهوائية لل المستدمية النزلية في نماذج الماوس لدراسة التهاب الشعب الهوائية

الهدف العام من هذه التجربة هو دراسة الاستجابات المناعية في الرئة أثناء العدوى البكتيرية. يمكن أن تساعد هذه المسألة في الإجابة على بعض الأسئلة الرئيسية في مجال التهاب الرئة مثل ما هي الآليات التنظيمية الرئيسية والجينات التي تمنع أو تعزز التهاب الرئة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها فعالة للغاية وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة بسبب التوصيل المباشر لللقاح البكتيري إلى الجهاز التنفسي السفلي.

للبدء ، طبق NTHi على طبق أجار الشوكولاتة. احتضان اللوحة رأسا على عقب طوال الليل ، عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، استزراع البكتيريا في مرق تسريب الدماغ والقلب.

ثم ، في أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، أضف ملليلتر واحد من المرق. قم بتدوير المزيج بوزن 4000 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من PBS.

كرر خطوة الغسيل هذه مرة أخرى. بعد ذلك ، قم بتخفيف 100 ميكرولتر من المحلول المعلق في 900 ميكرولتر من PBS ، وقم بقياس امتصاص الثقافة عند 600 نانومتر. استخدام هذه المعلومات لضبط اللقاح إلى 20 مليون CFUs في المليلتر.

بعد ذلك ، حدد الجدوى و CFUs لللقاح. استزراع من واحد إلى عشرة تخفيفات متسلسلة من المرق على أطباق أجار الشوكولاتة ، واحتضان الأطباق طوال الليل. ابدأ بتخدير الماوس ، والتحقق من تخديره بشكل كاف باستخدام قرصة إصبع القدم.

ثم ضع الفأر ضعيفا واحلق المنطقة البطنية من الرقبة. تطهير الجلد المكشوف. الآن ، ارفع جلد الجزء البطني العلوي من الرقبة باستخدام ملقط أسنان الفئران ، وباستخدام مشرط ، قم بعمل شق من نصف إلى سنتيمتر واحد فوق الغدة الصعترية.

ثم افصل العضلات بعناية لفضح القصبة الهوائية. في القصبة الهوائية ، قم بحقن 50 ميكرولترا من الهواء ببطء ، متبوعا ب 50 ميكرولترا من NTHi المحضر ، متبوعا ب 50 ميكرولترا أخرى من الهواء. لإجراء التحكم السلبي ، حقن المحلول الملحي بدلا من NTHi.

بعد الحقن ، احتفظ بالحيوان عموديا لمدة دقيقة تقريبا. بعد ذلك ، أغلق الشق بمادة لاصقة للأنسجة واحتفظ بالفأر راقد جانبيا ودافئا لمدة 10 دقائق تقريبا. بعد 24 ساعة من الإصابة ، قتل المصاب وافتح تجويف البطن بمقص تشريحي.

ثم قطع الشريان الأورطي البطني لنزيف. بعد ذلك ، قم بتعريض الجزء البطني من الرئة للوصول إلى القصبة الهوائية. تنبيب القصبة الهوائية بقسطرة قياس 20.

باستخدام القسطرة ، قم بغرس 0.8 مل من BALF المؤقت واجمع الغسيل عن طريق شفط الأسنان. كرر هذا الإجراء ثلاث مرات أخرى ، مع تجميع مجموعات الغسيل الأربعة في تعليق واحد. خذ كمية 100 ميكرولتر وقم بتدويرها لمدة دقيقتين بسرعة 2,000 دورة في الدقيقة.

قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليقها في المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء. قم بتدويرها وإعادة تعليق الحبيبات باستخدام 1x PBS. الآن ، احسب العدد الإجمالي للخلايا في 100 ميكرولتر من التعليق باستخدام مقياس كثافة الدم تحت تكبير 10x مع تلطيخ التريبان الأزرق.

ثم قم بإعداد الشرائح لتلطيخ الخلايا. Aliquot 100 ميكرولتر من تعليق BALF في الآبار المناسبة لشرائح السيتوبين ، وقم بتدوير الشرائح عند 500 غرام لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، جفف الشرائح لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وقم بتلطيخ الخلايا باستخدام صبغة Giemsa المعدلة وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.

استخدم الخلايا المتبقية للتحليلات اللاحقة ، مثل الحقائق والفحص المجهري متحد البؤر وما إلى ذلك. بعد جمع الغسيل من الرئة المصابة ، خذ قطعة من الرئة 20-40 ملليغرام واحتضانها في كاشف تثبيت الحمض النووي الريبي عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها ، متبوعا بتخزين طويل الأمد عند 80 درجة مئوية. عندما تصبح جاهزا ، اغسل عينات أنسجة الرئة في PBS بارد لإزالة كاشف تثبيت الحمض النووي الريبي.

بعد ذلك ، ضع الأنسجة في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مليلتر يحتوي على عازلة تحلل مع بيتا ميركابتو إيثانول. بعد ذلك ، باستخدام مقص صغير ، قم بتقطيع الأنسجة إلى قطع وتجانس القطع باستخدام مدقة آلية لمدة 20-40 ثانية. احتفظ بالمحللة على الثلج لمدة خمس دقائق ، ثم قم بتدويرها عند 18،000 جرام لمدة ثلاث دقائق.

قم بإزالة المادة الطافية بعناية وانقله إلى أنبوب جديد. ثم أضف حجما واحدا من 70٪ من الإيثانول وقم بترتيورث الخليط. دع الخليط يرتاح على حرارة 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى أربع دقائق.

بعد ذلك ، انقل ما يصل إلى 700 ميكرولتر إلى عمود دوران على أنبوب تجميع ملليلتر وقم بالطرد المركزي للعمود عند 9600 جم لمدة 15 ثانية. تخلص من التدفق ، أضف 350 ميكرولتر من مخزن الغسيل وكرر الدوران. بعد ذلك ، احتضان الغشاء ب 80 ميكرولتر من محلول DNase I لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ثم أضف 350 ميكرولتر من مخزن الغسيل إلى العمود وكرر الدوران. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من مخزن غسيل الحمض النووي الريبي. كرر الدوران القصير ، وتجاهل التدفق.

قم بغسلتين باستخدام مخزن غسيل الحمض النووي الريبي. أخيرا ، فوق أنبوب تجميع جديد ، أضف 30-50 ميكرولترا من الماء الخالي من RNase مباشرة إلى العمود وقم بتدويره لمدة دقيقة واحدة لجمع عينة الحمض النووي الريبي في التدفق. تم تنفيذ الإجراء كما هو موضح مع الفئران العادية والصحية.

أدى التثبيت داخل القصبة الهوائية إلى زيادة ملحوظة في عدد الكريات البيض في سائل غسل القصبات الهوائية للفئران الملقحة ب NTHi مقارنة بضوابط المعالجة المالحة. يظهر تحليل العد التفاضلي للكريات البيض بوضوح زيادة في تسلل العدلات. يؤكد تحليل الحقائق للخلايا في BALF أيضا زيادة عدد العدلات.

تظهر الأجزاء الملطخة ب HNE من أنسجة الرئة زيادة في التهاب مجرى الهواء. بشكل جماعي ، تشير هذه البيانات إلى أن التركيب داخل القصبة الهوائية يحفز التهاب مجرى الهواء في الفئران. في تجربة مماثلة على الفئران الطافرة والتحكم ، تم تحليل الحمض النووي الريبي لأنسجة الرئة عن طريق تسلسل النسخ الكامل.

بالمقارنة مع الضوابط من النوع البري ، أدى نقص الحكة إلى التعبير التفاضلي للعديد من الجينات. يعتقد أن الحكة هي منظم لمسارات الإشارات الالتهابية ، لذلك يمكن استخدام هذه النتيجة لتعزيز دراسات جديدة. طوال تطورها ، مهدت هذه التقنية الطرق للباحثين في مجال أمراض الرئة لاستكشاف إشارات الخلايا في الخلايا المناعية أثناء عدوى الرئة والالتهابات.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر اتخاذ احتياطات إضافية أثناء إجراءات مثل التعرض للقصبة الهوائية وتركيب البكتيريا في القصبة الهوائية. بمجرد إتقان ، يمكن إجراء التثبيت داخل القصبة الهوائية في غضون عشر دقائق ويمكن جمع سائل القارورة في غضون 10-15 دقيقة. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء أمور إضافية مثل تسلسل الحمض النووي الريبي ، وقياس التدفق الخلوي ، والحجب المناعي لمعالجة أسئلة إضافية مثل الجينات التي يتم تنظيمها أو تنظيمها.