التحقيق في وظيفة من Coronin (أ) في المجاعة الاستجابة المبكرة لل Dictyostelium discoideum من جانب تجميع فحوصات

الهدف العام من هذا الإجراء التجريبي هو التحقيق في استجابة الجوع المبكرة المعتمدة على Coronin-A ل Dictyostelium discoideum. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء التنموي ، مثل تحديد مسارات الإشارات والعوامل المشاركة في التطور المبكر ل Dictyostelium discoideum. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتمتع بالقدرة على توفير أداة للفحص الآلي وعالي الإنتاجية للعوامل والبروتينات المحفزة للتطور المشاركة في إشارات النمو المبكرة.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب المتغيرات المتعددة المتأصلة في الفحص ، مثل كثافة الخلايا ووقت الالتزام ووقت التطور. لبدء هذا الإجراء ، قم بزراعة خلايا DH1.10 أو خلايا تعاني من نقص corA في قارورة Erlenmeyer التي تحتوي على وسط HL-5 ، عند 22 درجة مئوية ، في حاضنة اهتزاز عند 160 دورة في الدقيقة. حافظ على كثافة الخلايا بين واحد في 10 إلى أربعة ، ومرتين في 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر.

لفحص تراكم الخلايا ، احصد 10 إلى 50 مل من خلايا DH1.10 التي تنمو في مرحلة السجل أو الخلايا التي تعاني من نقص corA المتولدة في خلفية DH1.10. الطرد المركزي لهم لمدة ثلاث دقائق عند 400 مرة جم. ثم كانت الخلايا مرتين في BSS.

بعد ذلك ، عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. بعد ذلك ، ضع الخلايا في صفيحة 24 بئر. اسمح لهم بالالتصاق لمدة ساعة واحدة عند 22 درجة مئوية في BSS.

بعد ذلك ، تصور تجميع الخلايا باستخدام الفحص المجهري بفاصل زمني ، والتقط صورا كل 135 ثانية. لفحص تأثير نبضات AMP الدورية المطبقة خارجيا على تطور خلايا DH1.10 ، أو الخلايا التي تعاني من نقص في الكورام DH1.10 ، قم بحصاد 10 إلى 50 مل من الخلايا وقم بطردها لمدة ثلاث دقائق عند 400 مرة جرام. بعد ذلك ، اغسلها مرتين في BSS.

عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا بكثافة واحدة في 10 إلى الخلايا السبع لكل مليلتر في BSS. بعد ذلك ، رج المزارع عند 22 درجة مئوية لمدة ساعتين عند 160 دورة في الدقيقة قبل وضع البقول.

بعد ذلك ، قم بتطبيق نبضات AMP الدورية باستخدام مضخة تمعجية يتم التحكم فيها بواسطة مؤقت. قم ببرمجة المضخة لتوصيل نبضة خمس ثوان من AMP الدوري كل ست دقائق ونصف على مدى خمس ساعات. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في التأكد من عدم غمر طرف حقن AMP الدوري باستمرار في المحلول، ولكن يتم غمره بشكل دوري فقط في الموجات الناتجة عن الهزاز.

بعد تطبيق AMP الدوري ، عد الخلايا مرة أخرى باستخدام مقياس كثافة الدم. بعد ذلك ، قم بوضع الخلايا في صفيحة 24 بئر واتركها تلتصق لمدة ساعة واحدة في BSS. بعد 16 ساعة ، تخيل تراكم الخلايا عند 22 درجة مئوية ، باستخدام الفحص المجهري للمجال الساطع باستخدام خمسة × ذاتي.

في هذا الإجراء ، قم بإعداد وسط مكيف طازج ، عن طريق جمع خلايا المرحلة اللوغاريتمية DH1.10 أو الخلايا التي تعاني من نقص في الكورام DH1.10 من الثقافات المهتزة بوسط HL5 ، عند 22 درجة مئوية. الطرد المركزي للخلايا لمدة ثلاث دقائق عند 400 مرة جرام. بعد ذلك ، اغسلها ثلاث مرات في PBM.

بعد ذلك ، عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ، ثم أعد تعليقها في PBM بكثافة واحدة في 10 إلى الخلايا السبع لكل مليلتر ورجها لمدة 20 ساعة عند 22 درجة مئوية عند 110 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 400 مرة جم لمدة ثلاث دقائق ، متبوعا بجمع الوسط المكيف. بعد ذلك ، قم بتوضيح الوسط عن طريق الطرد المركزي عند 8 ، 000 مرة جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، قم بتصفية الوسط المكيف من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر وتخفيفه ثلاثة أضعاف في PBM. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ، وقم بوضعها في صفيحة 24 بئر ، واتركها تلتصق لمدة ساعة واحدة عند 22 درجة مئوية. بعد ذلك ، استبدل المادة الطافية للخلايا بوسط مكيف معد مسبقا.

بعد 16 ساعة ، تصور تجميع الخلايا باستخدام الفحص المجهري للمجال الساطع باستخدام خمسة × ذاتي. هنا ، تظهر الخلايا التي تعاني من نقص في Coronin-A عيبا في التطور المبكر ، ولم تتمكن من تكوين مجاميع متعددة الخلايا ، وهي الخطوة الأولى خلال الدورة التنموية ل Dictyostelium discoideum. في هذا الشكل ، تم غسل النوع البري الخضري ، والخلايا التي تعاني من نقص corA ، وتجويعها لمدة ساعتين قبل أن تنبض مع أو بدون 15 أو دوري AMP ، كل ست دقائق ونصف لمدة خمس ساعات في التعليق.

تطبيق نبضات AMP الدورية الخارجية ، استعاد النمط الظاهري من النوع البري بالكامل. في هذا الشكل ، تم غسل الخلايا من النوع البري ونقص corA التي تنمو بشكل كبير في PBM ، وبذرها في ألواح متعددة الآبار ، وتحضنها في وسط مكيف تم الحصول عليه من النوع البري ، أو الخلايا الجائعة التي تعاني من نقص corA. تم التقاط الصور بعد 16 ساعة من زرع الخلايا.

Dictyostelium discoideum الذي يعاني من نقص corA ، قادرا على إنتاج جميع العوامل المطلوبة للحث التنموي ، لكنهم لم يتمكنوا من الاستجابة لها. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 20 ساعة ، بما في ذلك وقت الحضانة ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه بالنسبة للسلالات المختلفة ، ستكون هناك حاجة إلى تعديل متغيرات متعددة للفحص ، مثل كثافة الخلايا ووقت الالتزام ووقت التطور.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء التجزئة الكيميائية الحيوية والتحليل البروتيني اللاحق من أجل تحديد العوامل المشاركة في استجابة الجوع المبكرة ل Dictyostelium discoideum. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لدى المرء فهم جيد لكيفية إحداث التطور المبكر في Dictyostelium discoideum في ظل ظروف مغمورة ، باستخدام إما وسائط مكيفة ، بالإضافة إلى نبضات AMP الدورية.