التحقيق في وظيفة من Coronin (أ) في المجاعة الاستجابة المبكرة لل

إن الهدف العام من هذا الإجراء التجريبي هو استقصاء استجابة التجويع المبكرة المعتمدة على بروتين Coronin-A في كائن Dictyostelium discoideum. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال علم الأحياء النمائي، مثل تحديد مسارات التأشير والعوامل المشاركة في النمو المبكر لـ Dictyostelium discoideum. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في قدرتها على توفير أداة للفحص الآلي وعالي الإنتاجية لعوامل تحفيز النمو والبروتينات المشاركة في تأشير النمو المبكر.

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة بسبب المتغيرات المتعددة المتأصلة في المقايسة، مثل كثافات الخلايا، ووقت الالتصاق، ووقت التنمية. لبدء هذا الإجراء، قم بتنمية خلايا DH1.10 أو الخلايا التي تفتقر إلى corA في دورق إرلنماير يحتوي على وسط HL-5، عند 22 °C، في حاضنة هزازة بسرعة 160 rpm. حافظ على كثافة الخلايا بين 1 × 10⁴ و 2 × 10⁶ خلية/مليلتر.

لفحص تجمع الخلايا، يتم حصاد من 10 إلى 50 ملليلتر من خلايا DH1.10 النامية في طور النمو اللوغاريتمي أو الخلايا الناقصة في بروتين corA والمولدة في خلفية DH1.10. يتم طردها مركزياً لمدة ثلاث دقائق عند 400 ×g. ثم تُغسل الخلايا مرتين في محلول BSS.

بعد ذلك، قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). ثم قم بزراعة الخلايا في طبق يحتوي على 24 بئراً. اترك الخلايا لتلتصق لمدة ساعة واحدة عند 22 degrees Celsuis في محلول BSS.

بعد ذلك، قم بتصوير تجمع الخلايا باستخدام المجهر المسرع (time-lapse microscopy)، والتقط صوراً كل 135 ثانية. ولفحص تأثير نبضات cAMP المطبقة خارجياً على تطور خلايا DH1.10، أو خلايا DH1.10 الناقصة لـ corA، قم بحصد 10 إلى 50 ملليلتر من الخلايا وقم بطردها مركزياً لمدة ثلاث دقائق عند 400 ×g. بعد ذلك، اغسلها مرتين في BSS.

قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا لتصل كثافتها إلى 1×10⁷ خلية/مل في محلول BSS. ثم قم برج المزارع عند درجة حرارة 22 °C لمدة ساعتين وبسرعة 160 rpm قبل تطبيق النبضات.

بعد ذلك، يتم تطبيق نبضات من AMP الدوري باستخدام مضخة تمعجية يتم التحكم فيها بواسطة مؤقت. برمِج المضخة لتقديم نبضة من AMP الدوري لمدة خمس ثوانٍ كل ست دقائق ونصف على مدار فترة زمنية مدتها خمس ساعات. وتتمثل الخطوة الحاسمة في التأكد من أن طرف حقن AMP الدوري ليس مغموراً باستمرار في المحلول، بل يُغمر فقط بشكل دوري بفعل الموجات الناتجة عن الهزاز.

بعد تطبيق cyclic AMP، قم بعد الخلايا مرة أخرى باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). بعد ذلك، قم بتوزيع الخلايا في طبق يحتوي على 24 بئراً واتركها لتلتصق لمدة ساعة واحدة في BSS. بعد مرور 16 ساعة، قم بمعاينة تجمع الخلايا عند درجة حرارة 22 °C، باستخدام مجهر الحقل المضيء مع عدسة شيئية بقوة تكبير five x.

في هذا الإجراء، يتم تحضير وسط مكيف طازج عن طريق جمع خلايا DH1.10 في طور النمو اللوغاريتمي أو خلايا DH1.10 الناقصة لـ corA من المزارع المرججة في وسط HL5 عند 22 درجة مئوية. يتم طرد الخلايا مركزياً لمدة ثلاث دقائق عند 400 ×g. بعد ذلك، يتم غسلها ثلاث مرات في PBM.

بعد ذلك، يتم عد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، ثم يتم إعادة تعليقها في وسط PBM بكثافة 1 × 10⁷ خلية/مل، ورجها لمدة 20 ساعة عند درجة حرارة 22 درجة مئوية وبسرعة 110 دورة في الدقيقة. بعد ذلك، تُطرد الخلايا مركزياً عند 400 ×g لمدة ثلاث دقائق، ثم يُجمع الوسط المكيف. وأخيراً، يتم ترويق الوسط عن طريق الطرد المركزي عند 8,000 ×g لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.

بعد ذلك، قم بترشيح الوسط المُكيّف باستخدام مرشح بمسامية 0.45 micrometer وقم بتخفيفه بمقدار ثلاثة أضعاف في PBM. قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، ثم وزعها في لوح بـ 24 بئراً، واتركها لتلتصق لمدة ساعة واحدة عند 22 degrees Celsius. بعد ذلك، استبدل السائل الطافي للخلايا بوسط مُكيّف تم تحضيره مسبقاً.

بعد مرور 16 ساعة، قم بفحص تجمع الخلايا باستخدام مجهر المجال المضيء بعدسة شيئية بقوة تكبير 5x. هنا، تظهر الخلايا التي تعاني من نقص في Coronin-A خللاً في التطور المبكر، حيث كانت غير قادرة على تكوين تجمعات متعددة الخلايا، وهي الخطوة الأولية خلال الدورة التنموية لـ Dictyostelium discoideum. في هذا الشكل، تم غسل الخلايا الخضرية من النوع البري Wild type والخلايا التي تعاني من نقص في corA، وتجويعها لمدة ساعتين قبل تعريضها لنبضات من AMP الحيواني أو الدوري بتركيز 15، أو بدونها، كل ست دقائق ونصف لمدة خمس ساعات في حالة تعليق.

أدى تطبيق نبضات خارجية من cyclic AMP إلى استعادة النمط الظاهري للنوع البري (Wild type) بشكل كامل. في هذا الشكل، تم غسل خلايا النوع البري والخلايا التي تفتقر إلى corA، والتي كانت في مرحلة النمو الأسي، باستخدام PBM، ثم زُرعت في أطباق متعددة الآبار، وحُضنت في وسط مُكيّف تم الحصول عليه من خلايا النوع البري أو خلايا corA الجائعة. وقد التُقطت الصور بعد 16 ساعة من زراعة الخلايا.

كانت سلالات Dictyostelium discoideum التي تفتقر إلى جين corA قادرة على إنتاج جميع العوامل المطلوبة للحث النمائي، ولكنها لم تكن قادرة على الاستجابة لها. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 20 ساعة، بما في ذلك وقت الحضن، إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر أن السلالات المختلفة تتطلب ضبط عدة متغيرات في المقايسة، مثل الكثافة الخلوية، ووقت الالتصاق، ووقت النمو.

يمكن اتباع هذا الإجراء بإجراء تجزئة كيميائية حيوية وتحليل بروتومي لاحق لتحديد العوامل المشاركة في استجابة التضور المبكرة في *Dictyostelium discoideum*. بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يتكون لدى المشاهد فهم جيد لكيفية تحفيز التطور المبكر في *Dictyostelium discoideum* تحت ظروف الغمر، باستخدام إما الأوساط المشروبة أو نبضات أحادي فوسفات الأدينوسين الدوري.