الجمع بين نقرا الإسفار في الموقع التهجين مع Immunolabelling للكشف عن التعبير عن ثلاثة جينات في أقسام الدماغ ماوس

الهدف العام من هذه التجربة هو الكشف في وقت واحد عن التعبير عن ثلاثة جينات مختلفة في أقسام الدماغ ، باستخدام التألق المزدوج في الموقع متبوعا بالتلوين المناعي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل نوع الخلية الذي يعبر عن الجين الذي يثير اهتمامي؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنك لست بحاجة إلى جسم مضاد جيد للجين الذي تهمك لتتمكن من توطين تعبيره إلى نوع معين من الخلايا.

لتلخيص هذا الإجراء ، في اليوم الأول ، يتم قطع أقسام الأنسجة الثابتة وتجنينها باستخدام مجسات الحمض النووي الريبي ذات العلامات المختلفة بين عشية وضحاها. في اليوم الثاني ، يتم احتضان الأقسام بين عشية وضحاها بجسم مضاد يستهدف المسبار المسمى FITC. يقترن هذا الجسم المضاد ببيروكسيداز الفجل الحار ، الذي يحفز إضافة التيراميد الفلوري في اليوم الثالث.

بعد ذلك ، يتم استخدام جسم مضاد مترافق بالفوسفاتيز القلوي لاستهداف المسبار المسمى DIG. في اليوم الرابع ، يحفز هذا الإنزيم تكوين الراسب الفلوري عند تحضنه بمحلول Fast Red. ثم يتم احتضان الأقسام طوال الليل بجسم مضاد أساسي يستهدف البروتين ذي الأهمية.

أخيرا ، في اليوم الخامس ، يتم تصور هذا البروتين بجسم مضاد ثانوي مترافق بالفلوروفور. لبدء هذا الإجراء ، اختر استنساخ الحمض النووي الذي يحتوي على تسلسل (كدنا) للجين المعني بالبلازميد مع محفزات بوليميراز الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، قم بزراعة استنساخ الحمض النووي ، واستخرج البلازميد باستخدام مجموعة تنقية البلازميد صغيرة الحجم ، وتسلسلها باستخدام بادئات عالمية T7 و SP6.

هضم 10 إلى 20 ميكروغراما من الحمض النووي البلازميد باستخدام إنزيم تقييد يقطع الطرف الخمسة الرئيسي للخيط الحسي للحمض النووي (كدنا). احتضنها لمدة 1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية. ثم قم بتشغيل كمية صغيرة على هلام الاغاروز للتحقق من أن البلازميد خطي بالكامل.

لتنقية البلازميد الخطي ، أضف 1/10 من حجم ثلاثة أسيتات الصوديوم المولية ، ومجلد واحد من 10 ملليمولار Tris-HCl الفينول المعادل ، ومجلد واحد من كحول الكلوروفورم إيزوأميل. جهاز طرد مركزي عند 16 ، 000 جي ثانية لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، واستخراج المرحلة المائية العليا. ثم أضف حجما واحدا من الكلوروفورم IAA.

قم بالطرد المركزي عند 16 ، 000 Gs لمدة دقيقة واحدة ، واستخرج المرحلة المائية العليا. كرر هذه الخطوة مرة أخرى. ثم أضف مجلدين من الإيثانول ، واحتفظ به عند سالب 20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة أو طوال الليل.

بعد ذلك ، جهاز طرد مركزي عند 16 ، 000 جي ثانية عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، واغسل الحبيبات بنسبة 70٪ من الإيثانول البارد. ثم أعد تعليقه في TE بتركيز ميكروغرام واحد من (كدنا) لكل 2.5 ميكرولتر.

لتجميع المجسين ، حدد أولا بوليميراز الحمض النووي الريبي المناسب. بعد ذلك ، قم بإعداد تفاعل النسخ في المختبر ، ورفع الحجم النهائي إلى 20 ميكرولترا بالماء المعالج DEPC. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.

بعد ذلك ، قم بتشغيل ميكرولتر واحد من تفاعل النسخ على هلام الاغاروز بنسبة 1٪ للتحقق مما إذا كان التفاعل قد نجح. يجب أن يظهر الجل القالب الخطي وشريط ساطع من المسبار. في هذا الإجراء ، قم بقطع أجزاء بسمك 15 ميكرومتر من الأنسجة المجمدة في ناظم البرد.

اجمع الأقسام على شرائح المجهر ، واترك الشرائح لتجف لمدة ساعة للتأكد من أن الأنسجة تلتصق بالشرائح. العامل الأكثر أهمية في عمل هذا الإجراء بشكل جيد هو جودة الأقسام. يعتمد هذا جزئيا على وجود أنسجة جيدة النفخ وثابتة ، وجزئيا على تقنية التقسيم للحصول على أقسام مسطحة خالية من تلوث RNase.

بعد ذلك ، قم بتخفيف المجسين في مخزن مؤقت للتهجين تم تسخينه مسبقا إلى 65 درجة مئوية ، واخلطه جيدا. ضع 300 ميكرولتر من خليط التهجين على كل شريحة ، وقم بتغطيتها بغطاء مخبوز بالفرن. بعد ذلك ، احتضان الشرائح طوال الليل عند 65 درجة مئوية في غرفة رطبة.

في اليوم التالي ، انقل الشرائح إلى وعاء كوبلين يحتوي على مخزن غسيل مسخن مسبقا ، واغسل الشرائح لمدة 30 دقيقة ، مرتين ، عند 65 درجة مئوية. بعد ذلك ، اغسل الشرائح لمدة 10 دقائق ثلاث مرات بمحلول غسيل MABT في درجة حرارة الغرفة. في هذه الخطوة ، استخدم قلما مسعورا لرسم دوائر حول أقسام الأنسجة.

ثم احتضان الشرائح لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع مانع ISH في غرفة مرطبة. بعد ذلك ، احتضن الشرائح طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام جسم مضاد للفجل بيروكسيد. ثم ضع الشرائح في وعاء كوبلن يحتوي على PBST.

اغسلها في PBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة ، واستبدلها ب PBST طازج في كل مرة. بعد ذلك ، أضف تيروميد الفلورسنت إلى الشرائح واتركها لمدة 10 دقائق في الغرفة المعتدلة. ضع الشرائح في وعاء كوبلن واغسلها في PBST لمدة 10 دقائق ثلاث مرات.

بعد ذلك ، احتضان الشرائح باستخدام المخزن المؤقت الذي يحجب ISH لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، احتضن الشرائح طوال الليل عند أربع درجات مئوية بجسم مضاد مضاد للحفر مترافق بالفوسفاتيز القلوي. بعد ذلك ، اغسلها باستخدام MABT ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة.

بعد ذلك ، اغسل الشرائح مرتين باستخدام 0.1 مولار تريس هيدروكلوريك عند درجة الحموضة 8.2 لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بتصفية المحلول الأحمر السريع ، واحتضان الشرائح عند 37 درجة مئوية بمحلول أحمر سريع في غرفة رطبة. نظرا لاختلاف وقت التطور الأمثل ، تحقق من الشرائح بانتظام باستخدام مجهر الفلورسنت لمراقبة تكوين الرواسب.

ثم اغسلها ثلاث مرات باستخدام PBST لمدة 10 دقائق في كل مرة. لإجراء الكيمياء المناعية ، احتضان الشرائح باستخدام عازلة حجب IHC لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة. بعد ذلك ، احتضان الشرائح في محلول الجسم المضاد الأساسي عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي ، اغسل الشرائح باستخدام PBST لمدة 10 دقائق ثلاث مرات. احتضنها في محلول الجسم المضاد الثانوي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم اغسلها باستخدام PBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة.

بعد ذلك ، قم بتجفيف الشرائح جزئيا في درجة حرارة الغرفة وقم بتركيبها بوسط تركيب مضانة. اترك الشرائح حتى تجف قبل تصويرها في مجهر متحد البؤر. تظهر هنا الصور التمثيلية من ISH ل Aspa و Mbp ، متبوعة بالتلوين المناعي ل OLIG2 جنبا إلى جنب مع تلطيخ الخطاف.

تم التعبير عن Aspa في بعض الخلايا الإيجابية ل MBP OLIG2 في القشرة وفي الجسم الثفني. بعض الخلايا الإيجابية ل Mbp OLIG2 لا تعبر عن Aspa. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على الشرائح وجميع المحاليل خالية من تلوث RNase.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دراسة أنماط التعبير الجيني عن طريق تثبيط N-citrine والكيمياء المناعية. يمكن تكييف هذه التقنية مع مجموعة متنوعة من الأنسجة ذات الأصول المختلفة ومراحل النمو.