التنبؤ والتحقق من جين تنظيم عناصر المنشط خلال الريتينويك حمض المستحثة الجنينية الجذعية تمايز الخلايا

الهدف العام من هذا الفيديو هو توفير مجموعة متكاملة من الأساليب لتحديد العناصر التنظيمية الجينومية والتحقق من صحتها تجريبيا ، ما يسمى بالمعززات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في نسخ وتنظيم الأحداث البيولوجية ، بما في ذلك اختيار المحسن واستخدامه ، باستخدام تمايز الخلايا ، أو استجابة للمنبهات الخارجية. الميزة الرئيسية لتدفق العمل المقدم هي أنه يمكن تكييف البروتوكول بسهولة واستخدامه في أي أنظمة نموذجية خلوية.

سأوضح خطوات الإجراء. للبدء ، اختر محسنا مرشحا بناء على تحليل تسلسل الرقائق الموجود مسبقا. استخدم متصفح الجينوم لعرض نتائج تجربة تسلسل الرقاقة المطلوبة ، وتحديد مواقع الربط بالقرب من الجين محل الاهتمام.

اختر تحديد منطقة ذات أهمية للحصول على تسلسل زوج أساسي 200-400 للمنطقة الجينومية المحددة ، واستخدم التسلسلات لتصميم التمهيدي اللاحق. باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية ، قم بتضخيم واستنساخ المنطقة الجينومية المختارة في بناء بلازميد مراسل. لاختبار نشاط المحسن ، قم بتحويل المبلغ إلى خلايا جذعية جنينية جماعية عن طريق إضافة 200 لتر ميكرو من محلول الجيلاتين 0.1٪ لكل بئر إلى 48 لوحة بئر.

احتضن الألواح لمدة 30 دقيقة قبل الطلاء. في اليوم السابق للتعداء ، الجذع الجنيني الخالي من التغذية الصفيحية ، أو الخلايا الجذعية الجنينية ، في 250 لترا صغيرا من وسط ES بكثافة ثلاثة في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر. في يوم التعدي ، قم بإعداد خلطات البلازميد ، مما يكفي لثمانية آبار من كل مزيج.

أضف وسط مصل منخفض بجودة التعداء إلى كل مزيج بلازميد لرفع الحجم إلى 106 ميكرو لترات. بعد ذلك، أضف 4.5 لتر ميكرو من كاشف التعداء عالي الجودة ES، واخلطه بعناية عن طريق سحب العينات 15 مرة لأعلى ولأسفل. احتضان مزيج التعداء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الحضانة ، أضف 13 لترا صغيرا لكل بئر من مزيج التعداء إلى الخلايا واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات. بعد ذلك ، ضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة طوال الليل قبل العلاج بالأشنة. كفاءة الإرسال هي خطوة حاسمة.

إذا تم استخدام نوع خلية آخر، فإن هذه الخطوة تتطلب التحسين. استخدم نوع الخلية الأكثر صلة لاختبار نشاط المحسن لتقليل التأثيرات المعتمدة على السياق. في اليوم التالي ، قم بإزالة الوسط بعناية عن طريق الشفط ، وأضف 250 لترا صغيرا من الوسط الطازج لكل بئر يحتوي على مولر صغير واحد من حمض الريتينويك المتحولة ، أو DMSO كمركبة.

احتضان الخلايا لمدة 24-48 ساعة. بعد تحضير المخزن المؤقت للتحلل وفقا لبروتوكول النص ، قم بشفط الوسط بعناية من الخلايا. استخدم 1X PBS لرفع الخلايا مرة واحدة ، ثم أضف 200 لتر ميكرو من محلول التحلل 1X لكل بئر.

هز الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد ذلك ، من أجل تحلل الخلية بالكامل ، قم بتجميد تحلل الخلية في اللوحة عند 80 درجة مئوية. بعد إذابة المحللات تماما ، استخدم ماصة إلكترونية متعددة القنوات لنقل 80 لترا صغيرا من محللة الخلية إلى 96 صفيحة واضحة جيدا لبيتا جالاكتوزيداز ، و 40 لترا صغيرا من المحللة إلى صفيحة بيضاء لقياس لوسيفيراز.

لإجراء بيتا جالاكتوزيداز ، امزج ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت للركيزة بيتا غال مع أربعة ملليغرام من OMPG. بعد ذلك ، أضف 3.5 لتر ميكرو من بيتا ميركابتو إيثانول إلى الخليط وأضف على الفور 100 لتر ميكرو من المخزن المؤقت إلى 80 لترا صغيرا من محللة الخلية. احتضان التفاعلات عند 37 درجة مئوية حتى يتطور اللون الأصفر الباهت.

اقرأ الامتصاص عند 420 نانو متر على قارئ اللوحة ، وقم بتصدير البيانات. لإجراء اختبار لوسيفيراز ، بعد تحضير كاشف الركيزة وفقا لبروتوكول النص ، قم بتسخين كاشف ركيزة لوسيفيراز إلى درجة حرارة الغرفة قبل البدء. بعد ذلك ، قم بإدخال 100 لتر صغير في كل بئر من الصفيحة البيضاء التي تحتوي على 40 لترا صغيرا من محللة الخلية.

استخدم على الفور آلة عداد الإنارة لقياس الإشارة. احصل على الأنشطة من ثلاث عمليات نقل وتجارب مستقلة على الأقل. قم بإجراء عمليات الحساب لكلا المقايسين وفقا لبروتوكول النص.

لتصميم الاشعال للكشف عن الحمض النووي الريبي بواسطة RTCPR ، حدد منطقة جينومية على بعد 1.5 إلى كيلوغرامين على الأقل من أي نصوص جينية مشروحة. تحديد الاتجاه النسبي للجين ، وتحديد موضع النصوص الحسية والمضادة للإحساس. لتصميم بادئات لتقدير الحمض النووي الريبي المحسن ، اختر المناطق 200-1 ، 000 زوج أساسي من مركز موقع ربط عامل النسخ.

إذا كان الجين موجودا على الخيط الناقص ، فقم بنسخ 200-300 زوج أساسي من الخيط الموجب وقم بتحويل التسلسل للحصول على تسلسل المكمل العكسي. بعد ذلك ، استخدم هذا التسلسل لتصميم التمهيدي اللاحق. اضبط نطاق حجم المنتج بين 80-150 زوجا أساسيا.

لقياس نسخ الحمض النووي الريبي ، بعد عزل الحمض النووي الريبي الكلي عن الخلايا المعالجة وفقا لبروتوكول النص ، اكتشف الحمض النووي الريبي المنسوخ العكسي بواسطة RTCPR باستخدام إجراء قياسي. قياس mRNA غير المعتمد على العلاج للتطبيع. كما هو موضح هنا ، كشف تحليل المعلوماتية الحيوية لبيانات تسلسل رقاقة RXR التي تم الحصول عليها من الخلايا ES المعالجة بحمض الريتينويك عن تخصيب نصف موقع المستقبل النووي تحت المواقع المحتلة RXR.

باستخدام خوارزمية المعلوماتية الحيوية ، تم تعيين نتائج البحث عن الحافز لنصف الموقع مرة أخرى إلى بيانات تسلسل رقاقة RXR. حدد هذا التحليل قمم الرقائق المتداخلة مع مواقع ربط المستقبلات النووية المتعارف عليها. يشير تصور المواقع في IGV إلى إثراء عوامل النسخ القريبة من Hoxa1.

هدف RAR RXR تم تحديده سابقا. كما تم تحديد محسن عقابي لسلسلة مستهدفة جديدة من RA ، PRMT8. تم استنساخ مناطق المحسن المحددة في ناقل مراسل المعارف التقليدية لوسيفيراز ، وتم نقل الخلايا الجذعية الجنينية بهذه البنيات.

تم قياس نشاط لوسيفيراز في غياب ووجود التهاب المفاصل الروماتويدي. أظهرت التركيبات التي تحتوي على عنصر استجابة RA ، أو RARE ، زيادة في شدة إشارة لوسيفيراز عند معالجة RA ، بينما لم يتم تحفيز البناء بدون RARE. للتأكد مما إذا كان تعبير الحمض النووي الريبي الحمض النووي الريبي المضاد للمعنى للمحسن المرتبط ب Hoxa1 RAR RXR يرتبط بتعبير الرنا المرسال للجين ، تم أيضا قياس مستوى Hoxa1 eRNA. أكدت النتائج أن نشاط المحسن ناتج عن علاج التهاب المفاصل الروماتويدي على المدى القصير.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذا العمل في غضون أيام قليلة من خلال إجراء تجربة مصيدة المحسن الموصوفة وقياس القدر الكمي للمحسن ، يمكن للمرء أن يقدم دليلا وظيفيا قويا لنشاط المحسن. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد وتوصيف المعززات العقابية. بمجرد تحديد المحسن والتحقق من صحته ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل التقاط تأكيد الكروموسومات ، أو CCC ، من أجل الإجابة على أسئلة مهمة إضافية ، مثل الجين الذي ينظمه المحسن الذي تم التحقق من صحته؟