تقييم في وقت واحد Cardiomyocyte الحمض النووي تحضير والصيغة الصبغية: طريقة لمساعدة الكمي لCardiomyocyte التجديد ودوران

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحديد معدل دوران خلايا عضلة القلب باستخدام وضع العلامات على النيوكليوزيد على المدى الطويل وقياس التدفق الخلوي لتحديد نوى خلايا عضلة القلب الجديدة مع حساب تعدد الصبغيات في النوى. يمكن استخدام هذه الطريقة لمعالجة الأسئلة الرئيسية في مجال تجديد خلايا عضلة القلب ويمكن استخدامها كأداة فحص لتحديد التغيرات في ديناميكيات توليد خلايا عضلة القلب. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه يسمح بقياس دقيق ودقيق لتوليد خلايا عضلة القلب الجديدة ، بغض النظر عن المصدر الخلوي والتحكم في تعدد الصبغيات.

بعد 24 ساعة من حقنة EdU السادسة ، ضع المعالج في وضع الاستلقاء واستخدم مقصا جراحيا لعمل شق جلدي من منتصف البطن إلى الحجاب الحاجز. بعد ذلك ، قم بإبعاد القص عن تجويف الجسم ، وقطع الحجاب الحاجز بشكل ثنائي لفضح القلب. ثم ارفع القلب قليلا واقطع الأوعية الدموية الرئيسية لقناة التدفق لتشريح القلب من التجويف الصدري.

فور الحصاد ، ضع القلوب في أنابيب طرد مركزي فردية سعة 15 مل تحتوي على 10 مل من PBS مبردة إلى أربع درجات مئوية. ثم انقل العينات إلى أطباق بتري فردية مقاس 10 سم واستخدم مشرطا لتقطيع كل قلب إلى قطعتين في اتجاه سهمي. بعد ذلك ، اضغط برفق على قطع القلب باستخدام ملقط.

قم بإزالة قطعتي القلب وضعهما في طبق بتري يحتوي على 20 مل من PBS الطازج. كرر مرة أخرى مع طبق بتري جديد و 20 مل من PBS الطازج. ضع كلا الجزأين من القلبين في نفس أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل واستخدم إبرة قياس 25 لعمل ثقب صغير في غطاء كل أنبوب لمنع الغطاء من الفتح عند معالجة القلب.

ثم قم بتسمية كل أنبوب وتجميد أنسجة القلب في وعاء من النيتروجين السائل. لكل قلب يتم تحليله ، احتضن 36 مل من واحد بالمائة من BSA و PBS في أنبوب طرد مركزي فائق. تخلص من المحلول بعد 30 دقيقة.

عندما تجف الأنابيب في الهواء ، أضف 10 مل من محلول التدرج السكروز إلى كل أنبوب. بعد فرم عينات القلب المجمدة بالنيتروجين السائل بشكل فردي باستخدام المشرط ، انقل شظايا الأنسجة من كل قلب إلى أنابيب مخروطية فردية سعة 50 مل تحتوي على 15 مل من محلول تحلل الخلايا. قم بتجانس العينات لمدة 15 ثانية عند 25,000 دورة في الدقيقة باستخدام مجانس مسبار في درجة حرارة الغرفة.

ثم أضف 15 مل أخرى من محلول التحلل إلى كل أنبوب وانقل العينات واحدة تلو الأخرى إلى 40 مل مع مدقة خلوص كبيرة. قم بإجراء 10 ضربات باستخدام المدقة وقم بتصفية ملاط الخلية من خلال مصفاة 100 ميكرون متبوعة بمصفاة خلية 40 ميكرون في أنابيب طرد مركزي فردية سعة 50 مل. ثم اجمع الكريات القلبية النووية عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الخلايا في 25 مل من محلول تدرج السكروز لكل منهما.

ضع طبقة من الخلايا فوق تدرج السكروز الخالي من النوى في أنابيب الطرد المركزي فائقة التحضير وقم بالطرد المركزي للطبقات باستخدام دوار أنبوب متأرجح. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق كريات النوى في 1 ، 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتخزين النوى وانقل النوى إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يسمى PCM1. انقل 300 ميكرولتر من كل تعليق من أنابيب PCM1 إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وأضف 700 ميكرولتر من مخزن تخزين النوى الجديد والتحكم في ISO الملصق.

بعد ذلك ، قم بتسمية نوى PCM1 بجسم مضاد مضاد ل PCM1 ونواة التحكم ISO بجسم مضاد سريع للتحكم في النمط المتملي IGG بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بتدوير العينات وإعادة تعليق الكريات في مل واحد من مخزن تخزين النوى الطازجة لعملية طرد مركزي ثانية في ظل نفس الظروف. بعد الدوران الثاني ، قم بإعادة تعليق الكريات في مل واحد من المخزن المؤقت لتخزين النوى الطازجة واحتضان النوى بميكرولتر واحد من جزء F (ab'2 مترافق مترافق من جسم مضاد IGG مضاد للعنب لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية في الظلام.

لتقييم درجة دمج EdU ، قم بجهاز الطرد المركزي لنظام PCM1 و ISO للتحكم في معلقات النوى المسماة وإعادة تعليق الكريات في مل واحد من 1٪ BSA PBS مرتين لغسلتين متتاليتين. بعد الغسيل الثاني ، استبدل المادة الطافية ب 100 ميكرولتر من مثبت EdU واحتضان العينات لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. في نهاية التثبيت ، اغسل النوى مرتين أخريين في مل واحد من PBS BSA ثم احتضان العينات ب 100 ميكرولتر من محلول النفاذية القائم على الصابونين في درجة حرارة الغرفة.

بعد 15 دقيقة ، أضف 500 ميكرولتر من كوكتيل ملصقات EdU الطازج إلى كل أنبوب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، قم بتدوير العينات ثلاث مرات لغسل النوى في مل واحد من PBS BSA خلال جهازي الطرد المركزي الثانيين. أخيرا ، قم بتسمية العينات ب 400 ميكرولتر من محلول تلطيخ الحمض النووي.

يوضح التحليل المناعي للقلوب النبضية وجود PCM1 الذي يعبر عن خلايا عضلة القلب التي أدرجت EdU. ومع ذلك ، يمكن إساءة تفسير البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام الأساليب المناعية حيث يمكن التعرف بشكل خاطئ على أنواع الخلايا الأخرى التي أدرجت EdU على أنها خلايا عضلة القلب. في دراسة أجريت على mdx والفئران الضابطة ، يتيح تحليل قياس التدفق الخلوي المفصل في هذا البروتوكول القياس الكمي السريع للتوليد النووي لخلايا عضلة القلب الجديدة مع استبعاد الخلايا التي أدرجت EdU في إزالة تعدد الصبغيات.

على غرار البيانات المنشورة سابقا ، لوحظت في هذه التجربة التمثيلية زيادة في معدلات توليد نوى خلايا عضلة القلب الجديدة في قلوب الفئران mdx مقارنة بالضوابط المطابقة للعمر. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن إكمال هذه التقنية في أربع ساعات على مدار يومين. عند تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم تذكر كل من عناصر التحكم السلبية EdU و PCM1 حتى يمكن ضبط البوابات بدقة أثناء التحليل.

تتوافق هذه التقنية أيضا مع عدد من تقنيات الأنسجة المناعية الإضافية التي تسمح بدمج الخلايا النووية في عدد من أنواع خلايا القلب المختلفة. تم استخدام هذه التقنية في مجال أبحاث القلب والأوعية الدموية لدراسة التغيرات في تجديد خلايا عضلة القلب في نموذج mdx لاعتلال عضلة القلب غير الإقفاري. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد نوى خلايا عضلة القلب الجديدة بسرعة ، وشاهد العد في تعدد الصبغيات للكشف عن التغيرات في تجديد خلايا عضلة القلب ودورانها.