داخل الحرقفي حقن الشريان للنمذجة فعالة وانتقائية مجهرية العظام الانبثاث
سبتمبر 26, 2016
توفر هذه المخطوطة الإجراء التفصيلي لحقن الشريان الحرقفي (IIA) ، وهي تقنية لتوصيل الخلايا السرطانية على وجه التحديد إلى أنسجة الأطراف الخلفية بما في ذلك العظام لإنشاء نقائل العظام التجريبية. على الرغم من أنه تم إنشاؤه في البداية باستخدام نماذج أورام الثدي ، إلا أنه يمكن توسيع هذا البروتوكول بسهولة ليشمل أنواع السرطان الأخرى.
الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء ورم خبيث تجريبي للعظم عن طريق توصيل الخلايا السرطانية مباشرة إلى أنسجة الأطراف الخلفية ، بما في ذلك العظام ، عن طريق حقن الشريان الحرقفي. لذلك يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول استعمار العظام لسرطان الثدي ، خاصة في المرحلة المبكرة من هذه العملية ، كيف تتفاعل خلايا سرطان الثدي مع خلايا البيئة المكروية في العظام. قمنا بحقن الشريان الحرقفي اليوم.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تنشئ بكفاءة وانتقائية نموذجا تجريبيا لنقائل العظام المجهرية لأنواع مختلفة من السرطان دون التسبب في تلف الأنسجة الموضعية. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن العثور على حقنة دقيقة ، موضع حقن الشريان الحرقفي على المجهر قد يستغرق ممارسة لتحقيق معدل نجاح حقن أعلى من تسعين بالمائة. ابدأ بتأكيد المستوى المناسب من التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم لفأر يبلغ من العمر خمسة إلى ستة أسابيع عشرين جراما.
بعد وضع مرهم العين ، امسح منطقة الفخذ اليمنى المحلوقة عدة مرات باستخدام مسحات قطنية متسلسلة ومعقمة بنسبة 70٪ مبللة بالإيثانول الأيزوبروبيل ، متبوعة بمقشر جراحي من البيتادين. بعد ذلك ، قم بتغطية كل الماوس بستارة معقمة. بعد ذلك ، استخدم شفرة مشرط معقمة من الفولاذ الكربوني رقم عشرة ومقبض رقم ثلاثة لعمل شق جلدي من واحد إلى 1.2 سم بين الحلمتين الرابعة والخامسة في أسفل البطن الأيمن.
وانقل تحت مجهر تشريح قياسي على الطاولة. تحت هدف 4X ، أدخل ملقط فصل حاد في الشق بين الأنسجة الدهنية والصفاق ، وادفع الأنسجة للخارج على كلا الجانبين للكشف عن الأوعية الحرقفية والأعصاب. بعد ذلك ، استخدم ملقطا مستقيما ودقيقا لاختراق النسيج الضام بين الأوعية الدموية والعصب الأقرب إلى الأوعية.
بعد ذلك ، حرك الملقط بزاوية عبر النسيج الضام وتحت الأوعية الحرقفية ، مع إدخال الملقط المستقيم في الأنسجة الضامة على الجانب الآخر من الأوعية لتوجيه الملقط الزاوي عبر الأنسجة. نوصي بفصل ورفع الحافة الحرقفية والشريان كحزمة لهذه الخطوة. على الرغم من أن الخلايا السرطانية يتم حقنها فقط في الشريان ، إلا أنها توفر الوقت والجهد لعزل كلا الوعاءين معا.
بمجرد وضع الملقط الزاوي في مكانه ، افصل الوريد الحرقفي والشريان عن الأنسجة المحيطة ، مع إبقاء الأوعية فوق الملقط الزاوي أثناء التشريح. عندما تكون الأوعية صافية ، استخدم الملقط المستقيم لتوصيل طرف خياطة حريرية 4-0 إلى الملقط المائل واسحب الخيط ببطء ورفق أسفل الأوعية. يجب بعد ذلك تثبيت كل من الوريد الحرقفي المشترك والأوعية الشريانية بواسطة الخياطة.
عندما تكون الأوعية جاهزة، قم بتحريك الخلايا السرطانية لأعلى ولأسفل عدة مرات لإعادة تعليقها في محلول خلية واحدة وتفتيت أي كتل. بعد ذلك ، استنشق 100 ميكرولتر من الخلايا لكل فأر في حقنة أنسولين قياس 31. الآن ، حرك الملقط الزاوي للخلف أسفل الأوعية باستخدام الخيط كدليل ، وافتح الملقط بحيث تستقر الأوعية برفق على الأطراف.
من ناحية أخرى ، أدخل طرف الإبرة المائل لأعلى في تجويف الجزء من الشريان بين أطراف الملقط. اضغط على المكبس ببطء لحقن الخلايا. سيؤدي تعليق الخلية إلى طرد الدم عبر الوعاء.
عندما يتم تسليم جميع الخلايا ، قم بإزالة الإبرة برفق ، مع إبقاء الأوعية مرفوعة على الملقط لمنع النزيف. ثم اسحب الخيط بعيدا. أخيرا ، قم بإزالة الملقط بسرعة واضغط على قطعة قطن على الشق لمدة خمس إلى 10 دقائق لوقف النزيف.
هنا ، يتم عرض صورة تمثيلية للحيوان الكامل بعد الحقن داخل الشريان الحرقفي خمسة أضعاف 10 إلى خلايا سرطان الثدي MCF-7 الخامسة المسماة GFP ، متبوعة بإعطاء d-luciferin عن طريق حقن الجيوب الأنفية المدارية الرجعية. في اليوم 14 بعد الحقن ، تم الحصول على إشارة تلألؤ بيولوجي قوية من العظم الخلفي المحقون داخل الشريان الحرقفي ، ولكن ليس من عظم التحكم المقابل ، مما يؤكد التوطين المحدد للخلايا المحقونة. أظهر تقسيم تلطيخ H & E للعظام الحاملة للورم أيضا مجموعة خلايا مضغوطة تشبه الحصى مع نوى كبيرة تدل على آفات نقيلية مجهرية MCF-7 في أنسجة العظام بعد 14 يوما من حقن الشريان الحرقفي.
علاوة على ذلك ، كشف تلطيخ المناعي لأقسام العظام أيضا عن اختلاط خلايا MCF-7 مع بانيات العظم وبانيات العظم. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون عشر إلى خمس عشرة دقيقة. باتباع هذه الإجراءات ، يمكنك استخدام طرق أخرى للإجابة على أسئلة إضافية.
على سبيل المثال ، يمكننا استخدام RNA-Seq لتعريف خلايا البيئة المكروية في مكانة ورم خبيث ومقارنتها بالخلايا الطبيعية. توفر هذه التقنية طريقة واحدة للباحثين في سرطان الثدي والباحثين في سرطان البروستاتا لدراسة ورم خبيث دقيق في العظام في. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء نموذج ورم خبيث في العظام لسرطان الثدي عن طريق الحقن داخل الشريان الحرقفي.
يرجى اتخاذ الاحتياطات المناسبة لأن العمل مع الكيتامين والزيلازين قد يكون خطيرا للغاية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تفصل هذه المخطوطة تقنية الحقن في الشريان الحرقفي الداخلي (IIA) لإيصال الخلايا السرطانية إلى أنسجة الطرف الخلفي، بما في ذلك العظام، لإنشاء نقائل عظمية تجريبية. وتعد هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لدراسة تفاعلات خلايا سرطان الثدي مع البيئة الدقيقة للعظام.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- علم الأورام
- التقنيات التجريبية
خلفية علمية
- تعد النقيلة العظمية من المضاعفات الشائعة لدى مرضى السرطان.
- يعد فهم آليات استعمار الخلايا السرطانية في العظام أمراً بالغ الأهمية لتطوير العلاجات.
- تسمح طريقة الحقن في الشريان الحرقفي الداخلي بالتوصيل الموجه للخلايا السرطانية.
- تقلل هذه التقنية من تلف الأنسجة الموضعية مقارنة بالطرق الأخرى.
الغرض من الدراسة
- إنشاء نموذج لدراسة النقائل العظمية.
- استقصاء التفاعلات بين خلايا سرطان الثدي وخلايا البيئة المجهرية للعظم.
- تحسين دقة ومعدل نجاح تقنية الحقن.
الطرق المستخدمة
- حقن الخلايا السرطانية في الشريان الحرقفي الداخلي.
- استخدام نموذج فأر يبلغ من العمر خمسة إلى ستة أسابيع.
- مراقبة مستويات التخدير عن طريق قرص الإصبع.
- التدرب على تقنيات الحقن لتحقيق معدلات نجاح عالية.
النتائج الرئيسية
- تتيح هذه التقنية إنشاء نماذج لنقائل العظام بكفاءة عالية.
- يمكن تحقيق معدلات نجاح مرتفعة من خلال الممارسة.
- يُلاحظ حدوث حد أدنى من تلف الأنسجة الموضعي عند استخدام هذه الطريقة.
- يتم اكتساب رؤى حول المراحل المبكرة من استعمار خلايا سرطان الثدي.
الاستنتاجات
- يُعد الحقن في الشريان الحرقفي الداخلي أداة قيمة في أبحاث السرطان.
- يمكن تكييف هذه الطريقة لتناسب أنواعاً مختلفة من السرطان بخلاف سرطان الثدي.
- يمكن للدراسات الإضافية أن تعزز فهم التفاعلات بين السرطان والعظام.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
لا يزال إنشاء نماذج موثوقة لنقائل العظام في مراحلها المبكرة يمثل تحدياً حاسماً في اكتشاف أدوية الأورام، لا سيما عند تقييم التدخلات العلاجية التي تستهدف الاستعمار النقائلي المجهري. تتيح تقنية الحقن في الشريان الحرقفي الداخلي انتشار الخلايا السرطانية إلى عظام الطرف الخلفي بشكل متزامن مكانياً وزمانياً، مما يدعم القياس الكمي الدقيق للخلايا الورمية المنتشرة ويقلل من الاستجابات الالتهابية المربكة الناتجة عن تلف الأنسجة أثناء الإجراء. يعزز هذا النهج الثقة التنبؤية في الدراسات قبل السريرية من خلال السماح بالمراقبة المستمرة للآفات العظمية الخاملة دون حدوث نقائل في الأعضاء الجهازية، مما يؤدي بدوره إلى تحسين الصلة الترجمية لنماذج نقائل العظام في جهود التحقق من الأهداف وتحديد المركبات الرائدة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال نمذجة التفاعلات المبكرة للخلايا السرطانية مع مكونات البيئة الدقيقة للعظام، مثل الخلايا البانية للعظم والخلايا السلفية البانية للعظم.
- القيمة التشغيلية: يوفر مساراً اختيارياً وفعالاً لإيصال الخلايا السرطانية إلى عظام الطرف الخلفي، مما يسهل إنشاء نماذج متسقة عبر المجموعات التجريبية.
- القيمة الاستراتيجية: يدعم تقليل المخاطر الميكانيكية لمسارات الانتقال العظمي من خلال السماح بتصور تطور النقائل الدقيقة من خلايا مفردة إلى آفات متعددة الخلايا عبر القراءات المضيئة بيولوجياً والنسيجية.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يُنتج مخرجات قابلة للقياس الكمي مثل شدة الإشارة ذات الضيائية الحيوية وكثافة الآفات النسيجية، مما يتيح تقييماً معيارياً لعبء النقائل السرطانية.
- القيمة التشغيلية: يتجنب تلف الأنسجة الموضعي والعوامل المربكة المرتبطة بالتئام الجروح، مما يحسن من إمكانية تكرار المقايسة ويقلل من التباين في التحليلات اللاحقة.
- القيمة الاستراتيجية: يُنتج أنظمة ذات صلة بالمرض مع الحد الأدنى من النقائل في الأعضاء غير المستهدفة، مما يسمح بنوافذ ملاحظة ممتدة لدراسات الاستجابة للجرعة والتوقيت في حملات الفرز.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يتوافق مع الأنظمة ذات الصلة بالمرض من خلال رصد التطور من الخلايا الورمية المنتشرة إلى النقائل المجهرية في العظام، والتي تمثل عنق زجاجة سريري رئيسي.
- القيمة التشغيلية: يتيح الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري من خلال دعم التصوير الطولي وتحليلات نقطة النهاية مثل صبغ H&E والصبغ المناعي الفلوري.
- القيمة الاستراتيجية: يوجه قرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر من خلال توفير إشارات فعالية مبكرة للمركبات التي تعطل الاختلاط المشترك بين السرطان والسدى أو تكوين المكان المتخصص في البيئة الدقيقة للعظام.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تندرج طريقة الحقن في الشريان الحرقفي الداخلي ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف، مروراً بتحديد المركب الرائد، وصولاً إلى اختبار الفعالية في المرحلة قبل السريرية، ولا سيما بالنسبة للعلاجات الموجهة نحو العظام حيث تساهم نماذج النقائل المبكرة في تعزيز الفهم الميكانيكي وتحديد النوافذ العلاجية.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بالتفاعلات بين الخلايا السرطانية والبيئة الدقيقة للعظام من خلال تمكين التوصيل المتحكم فيه للخلايا الورمية إلى المواقع الهيكلية.
- الفحص: يوفر أنظمة بيولوجية جاهزة للمقايسة مع قراءات كمية للتلألؤ البيولوجي والنتائج الهيستوباثولوجية المناسبة لمنصات الفحص عالية المحتوى.
- التحليلات: يولد متغيرات تابعة قابلة للقياس تشمل التدفق الفوتوني من التلألؤ البيولوجي، ومساحة الآفة في المقاطع النسيجية، ومؤشرات التوطن المشترك للخلايا الورمية والخلايا السدوية.
- الأبحاث الترجمية: يربط بالتسلسل قبل السريري من خلال نمذجة المرحلة المجهرية النقيلية غير الوعائية، والتي تسبق التطور المذيب للعظم أو باني العظم في حالات نقائل العظام السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يمثل تقنية جراحية معيارية قابلة للتطبيق عبر أنواع السرطانات والمختبرات المختلفة، مما يعزز الاتساق بين المشاريع في إنشاء نماذج نقائل العظام.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال تقليل الضجيج الناتج عن الالتهابات الإجرائية وتمكين العزو الواضح للتغيرات المظهرية إلى آليات عمل الدواء.
- القيمة التشغيلية: تعزز التوحيد القياسي وقابلية التكرار من خلال معالم تشريحية محددة وعزل للأوعية بتوجيه من الغرز الجراحية، مما يقلل من التباين المعتمد على المشغل.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن كفاءة اتخاذ قرارات المتابعة أو الإيقاف (go/no-go) من خلال توفير قراءات مبكرة لانتشار الورم في أعضاء محددة، مما يقلل من حالات الفشل في المراحل المتأخرة بسبب الميل غير المتوقع للعظام (bone tropism).
- التأثير على المحفظة البحثية: تسهل تحديد الأولويات للمرشحات التي تستهدف العظام وفقاً للمخاطر المعدلة، وذلك من خلال تمكين المقارنة المباشرة لعبء الانتشار الورمي عبر أذرع العلاج في نماذج متماثلة جينياً (syngeneic) أو نماذج الطعوم الغريبة (xenograft).
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب إتقان تقنيات الجراحة المجهرية، بما في ذلك عزل الأوعية الدموية وربط الغرز تحت مجهر التشريح.
- يعتمد على توفر مجاهر تشريح معقمة، وملاقط دقيقة، ومحاقن إنسولين، ومعدات تحضير معلق خلوي متساوي التوتر.
- يستلزم توحيد بروتوكولات التخدير (مثل ketamine/xylazine) والمراقبة بعد الجراحة بين الفرق لضمان رفاهية الحيوان واتساق النموذج.
- تشمل اعتبارات التكييف تعديل حجم الحقن وتركيز الخلايا بناءً على مدى عدوانية الخط الخلوي السرطاني وتباين سلالة الفئران.
- تشمل القيود العملية وجود منحنى تعلم لتحقيق معدل نجاح في الحقن يتجاوز 90%، والحاجة إلى اتباع تقنية تعقيم صارمة لمنع تلوث الصفاق أثناء شق منطقة الأربية.
