Name: عزل خلايا الفأر التاجي غشائي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: تعلم عزل خلايا الفأر التاجي غشائي لأبحاث القلب والأوعية الدموية باستخدام تقنية CD31 والخرز المغناطيسي. هذه الطريقة توفر خلايا عالية النقاوة لدراسة آليات الأمراض القلبية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل منحة من المعاهد الوطنية للصحة (HL115578 لألف ماكينو).

وتمت الموافقة على الأبحاث على الفئران عن طريق لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة أريزونا وأجريت وفقا للمعهد الوطني للصحة (NIH) المبادئ التوجيهية. ملاحظة: أقسام 1، ينبغي أن يتم 2 و 3 من هذا اليوم قبل التجربة كما الإعداد. 1. حلول إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عازلة CD31 (50 مل) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 مل 1 × الفوسفات مخزن المالحة (PBS) إلى أنبوب 50 مل. تزن 0.05 غرام الأبقار مصل الزلال (BSA) و0.037 غرام ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) وإضافة إلى أنبوب 50 مل ووضع أنبوب لتدوير لمدة 1 ساعة حتى يذوب المسحوق. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4، تصفية من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر في أنبوب 50 مل الجديد، وتخزينها في 4 مئوية حتى الاستخدام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هانك المتوازن محلول الملح (HBSS) مع HEPES (500 مل) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.1915 غرام من HEPES لجعل 10 ملي HEPES في حل HBSS وتخلط جيدا. قياس درجة الحموضة والتكيف مع 7.4. تصفية وتخزينها في 4ج. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 1X كريب (1 لتر) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 مل من محلول 10 × كريب [الجدول 1] لمضاعفة الماء المقطر في قارورة 1 لتر. تزن 2.1 غرام بيكربونات الصوديوم و 2 ز D-الجلوكوز وإضافة إلى القارورة. خلط وضبط الحجم الإجمالي إلى 1 L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل فقاعة مع 95٪ O 2/5٪ CO 2 الغاز لمدة 30 دقيقة ومرشح حل داخل غطاء محرك السيارة. تخزين في 4 ج والحفاظ على الجليد أثناء التجربة. </li></ol></li></ol> 2. إعداد الخرز المغناطيسي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل العازلة CD31 في كل أنبوب 1.5 مل (أنبوب واحد لكل عينة). مزيج من الأغنام لمكافحة الفئران الخرز مفتش وإضافة كمية مناسبة لكل عينة [الجدول 1]. تهز أنابيب بقوة 30 مرات ووضعها في لوحة المغناطيسي لمدة 1 دقيقة من اهتزاز. فتح أنابيب بينما كان في لوحة وتفريغ الحلول في دلو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل العازلة CD31 في كل أنبوب. إضافة 2 ميكرولتر الفئران لمكافحة فأر CD31 المضادةالجسم إلى كل أنبوب وتدوير أنابيب O / N عند 4 درجات مئوية. </li></ol> 3. التعقيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف جميع أدوات الجراحة ونصائح ماصة. قطع نهايات نصائح ماصة بحيث هناك نصائح مع 4 بأقطار مختلفة، من أوسع إلى أضيق. بأقطار التقريبية للالنصائح 3 ملم، 2.5 ملم، 2 ملم، و 1.5 ملم على التوالي. قطع النصائح وتعقيم قبل يوم واحد مع 30 دقيقة من التعقيم عند درجة حرارة 121 درجة مئوية. ملاحظة: 4 أقسام - 11 ينبغي الاضطلاع بها في يوم من التجربة. </li></ol> 4. حلول إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد غسل العازلة التي تحتوي على 2٪ الحديد المحصنة العجل المصل (المحفل) في M199. للتصوير، وإعداد 30 مل / الماوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل انزيم (10 مل / العينة). تزن 0.6 وحدة / مل من Dispase و 1 ملغ / مل من كولاجيناز من النوع الثاني في أنبوب 50 مل. إضافة M199 وتدوير الأنبوب في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تصفية من خلال تصفية 0.2 ميكرومتر في أنبوب 50 مل الجديد insidالبريد غطاء محرك السيارة والحفاظ على 4 مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد HBSS / HEPES مع الهيبارين. إضافة 10 مل من HBSS مع 10 ملي HEPES في 15 مل أنبوب. إضافة 100 ميكرولتر من الهيبارين إلى الأنبوب والحفاظ على 4 مئوية حتى الاستخدام. </li></ol> 5. غسل الخرز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اخراج الأنابيب مع حبات من محور دوار عند 4 درجات مئوية وتقديمهم إلى غطاء محرك السيارة. وضع أنابيب في لوحة المغناطيسية ويهز لمدة 1 دقيقة. تفريغ حل وإضافة عازلة CD31 1 مل في كل أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ أنابيب للخروج من لوحة مغناطيسية ويهز بقوة 30 مرة. وضع الأنابيب مرة أخرى في لوحة مغناطيسية وتكرار لما مجموعه 3 يغسل. بعد الانتهاء، ووضع الأنابيب إلى 4C والحفاظ على الدورية حتى الاستخدام. </li></ol> 6. تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الفئران داخل الصفاق مع 0.1 مل من الهيبارين لمنع تخثر الدم. انتظر لمدة 10 دقيقة، ثم تخدير الفئران باستخدام حقن داخل الصفاق من 0.01 مل بنتوباربيتال. تحقق مما إذا كان الماوس هو شعور<html> الألم عن طريق معسر القدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على لوحة البوليسترين مع رئيس المتابعة وعقد تسلح مع الدبابيس. استخدام ملقط وصعبة قطع مقص لقطع الجلد في منطقة الصدر العلوية يصل إلى الحلق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اجراء خفض في وسط القفص الصدري فقط فوق الحجاب الحاجز. قطع العظام جانبية وصعودا نحو الحلق لجعل مثلث تعريض القلب والرئتين. قطع الشريان الأبهر فوق الحجاب الحاجز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد الغدة الصعترية مع ملقط دون سحب واستخدام المقص لقطع أي نوع من الأنسجة الضامة بعناية لإزالة الرئتين والقلب معا. مكان الأنسجة في كوب مع 1 × وكريب، يهز مع ملقط ونقل إلى 6 سم الطبق مع 1 × كريب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة فصوص الرئة باستخدام مقص وملقط. ادخال قسطرة معقمة 20 G في الشريان الأورطي. تدفق الدم في الدورة الدموية التاجية مع HBSS / الهيبارين. جعل قطع صغير في البطين، يهز القلب ونقل إلى أنبوب عينة من M199. إبقاء الأنابيب على الجليد. </li></ol><html> الطبقة = &quot;jove_title&quot;&gt; 7. الأنسجة الهضم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل قلب لطبق 6 سم مليئة 10 مل من محلول أنزيم واللحم المفروم إلى قطع صغيرة باستخدام المقص. ضع الأطباق في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تستنهض الهمم المواد هضمها من قبل pipetting صعودا وهبوطا 30 مرة خلال قمة مع نهاية قطع للسماح الأنسجة بالمرور أسهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضعه مرة أخرى في درجة مئوية حاضنة 37 لمدة 15 دقيقة أخرى. كرر التحريض ثلاث مرات، في كل مرة باستخدام ماصة نصائح من أكبر الفتحات إلى أضيق و 15 حضانة دقيقة بين كل منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 15 دقيقة الماضية الحضانة، وأخذ عينات من وإلى غطاء محرك السيارة. حل الماصة صعودا وهبوطا 30 مرات باستخدام الماصة غيض مع أضيق افتتاح ويمر عبر مصفاة 40 ميكرومتر الخلية في أنبوب 50 مل الجديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الطبق مع غسل العازلة 10 مل باستخدام ماصة 10 مل ونقل على مصفاة الخلية. وضع 50 مل أنابيب في أجهزة الطرد المركزي وتدور في 400 غ لمدة 10 دقيقة في RT. </li></ol>itle &quot;&gt; 8. الغسل والإقتران مع الخرز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف دون الإخلال بيليه. غسل الخلايا مع غسل العازلة 5 مل مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على واحد من قبل إعداد 1.5 مل أنابيب مع الخرز والعمل على أنبوب واحد في وقت واحد. وضع واحد أنبوب 1.5 مل في لوحة المغناطيسية، يهز 3 مرات وفتحه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي الماضي، وإزالة أكبر قدر من طاف وقت ممكن دون الإخلال بيليه. تنأى كتل الخلايا التي يسددها بقوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة غسل العازلة 1 مل إلى 50 مل أنبوب ومزيج الخلايا مع ماصة 1 مل. تفريغ الحل من أنبوب 1.5 مل وإضافة 1 مل من تعليق خلية من الأنبوب 50 مل إلى الخرز. نفض الغبار الأنابيب 30 مرات ثم تناوب على 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. </li></ol> 9. إعداد للثقافة خلية / التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد غرف لخلايا الطلاء. إضافة محلول الجيلاتين (5٪ ث / ت، 300 ميكرولتر) إلى غرفة البئر إلى معطف السطح واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة، وعينيالجيلاتين اوفه وجافة السطح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اخراج الأنابيب مع الخرز / الخلايا بعد 30 دقيقة من دوران وضعت في لوحة المغناطيسية داخل غطاء محرك السيارة. يهز لمدة 2 دقيقة، تفريغ وإضافة غسل العازلة 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتخذ أنابيب من لوحة، ويهز بقوة 30 مرات ثم نفض الغبار 30 مرة. وضعها من جديد في لوحة المغناطيسية ويهز لمدة 1 دقيقة. تكرار 4 مرات ليصبح المجموع 5 يغسل، ولكن مع 1 دقيقة تهتز على لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل الماضي، واخراج أنبوب واحد والعمل على كل أنبوب واحد في وقت واحد. يهز 30 مرات ثم نفض الغبار 30 مرة. وضعه على لوحة المغناطيسية ويهز لمدة 1 دقيقة. تفريغ وإضافة 1 مل 20٪ المحفل EC وسائل الإعلام (قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هزة بقوة 30 مرات ثم نفض الغبار 30 مرة. ضبط الماصة 500 ميكرولتر والماصة صعودا وهبوطا 10 مرات. نقل 500 ميكرولتر لكل غرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع في 37 درجة مئوية الحاضنة وترك O / N. وفي اليوم التالي، وغسل الخلايا مع 10٪ سائل الإعلام FBS EC. </li></ol> 10. إعداد لغرب وصمة عار (WB) عينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تاكالبريد من الأنابيب مع الخرز / الخلايا بعد 1 ساعة من التناوب. وضعها في لوحة المغناطيسية ويهز لمدة 2 دقيقة. تفريغ طاف وإضافة 1 مل الباردة HBSS. هزة بقوة 30 مرات ثم نفض الغبار 30 مرة. كرر مرتين لمدة 3 يغسل، ولكن مع 1 دقيقة تهتز على لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل الماضي، ووضع أنابيب على لوحة المغناطيسية ويهز لمدة 1 دقيقة. إزالة العازلة باستخدام ماصة وليز الخلايا لمدة WB باستخدام الطريقة الموصوفة سابقا 11،12. عادة ما تحتوي على المحللة جمعوا حوالي 30 ميكروغرام من البروتين. </li></ol> 11. التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا 3 مرات مع وسائل الإعلام، مع الحجم النهائي من 250 ميكرولتر للغرفة. إضافة 1.5 ميكرولتر من دل-acLDL إلى الخلايا. من هذه النقطة، والحفاظ على الخلايا في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 3.5 ساعة عند 37 مئوية. إضافة 1.5 ميكرولتر من هويشت، وتخلط جيدا واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 خلايا ˚C.Wash مع برنامج تلفزيوني وإصلاح مع 4٪ لامتصاص العرق (PFA) لمدة 20 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني ومنع مع 5٪ BSA-برنامج تلفزيوني لمدة 30 ميلن في RT. يغسل مرتين مع 1٪ BSA-برنامج تلفزيوني. تمييع BS-كتين-FITC باستخدام 1٪ BSA-برنامج تلفزيوني إلى تركيز من 2 ميكروغرام / مل وإضافة 300 ميكرولتر لكل غرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضعت غرفة على شاكر المداري في RT لمدة 30 دقيقة. يغسل مع برنامج تلفزيوني 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور الخلايا تحت المجهر الفلورسنت مع مرور الوقت تعرض 200 ميللي ثانية لFITC (تلطيخ كتين، علامة EC، الإثارة / انبعاث 488 نانومتر / 519 نانومتر)، 30 ميللي ثانية للدابي (هويشت، والتلوين، والإثارة / الانبعاث النووي في 358 نانومتر / 461 نانومتر)، و 300 ميللي ثانية لTRITC (acLDL تلطيخ، علامة EC، الإثارة / الانبعاثات في 557 نانومتر / 576 نانومتر). الحصول على صور باستخدام 20X عدسة الهدف. </li></ol>

<ol><li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell functions.</a> J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).</li>
<li>Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+in+focus%3A+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cells in focus: endothelial cell.</a> Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).</li>
<li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91, 3527-3561 (1998).</li>
<li>Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+function+and+dysfunction%3A+testing+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance.</a> Circulation. 115, 1285-1295 (2007).</li>
<li>Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+vascular+endothelial+cells+from+murine+heart+and+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung.</a> Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).</li>
<li>Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+connexin40+is+associated+with+coronary+endothelial+cell+dysfunction+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from murine tissue.</a> J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).</li>
<li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).</li>
<li>Nolan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+tissue-specific+microvascular+endothelial+cell+heterogeneity+in+organ+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration.</a> Dev Cell. 26, 204-219 (2013).</li>
<li>Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+pulmonary+endothelial+cells+from+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O-GlcNAcase+overexpression+reverses+coronary+endothelial+cell+dysfunction+in+type+1+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).</li>
<li>Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VDAC%3A+old+protein+with+new+roles+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">VDAC: old protein with new roles in diabetes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

الخلايا البطانية الأكثر استخداما على نطاق واسع في مجال البحوث والوريد السري الخلايا البطانية الإنسان (HUVECs) بسبب الراحة وسهولة زراعة. ومع ذلك، هناك الكثير من الأبحاث يتطلب توافر نموذج الفسيولوجية التي حققتها عزل الخلايا البطانية من أجهزة محددة أخرى 10. الخلايا البطانية تشكل السكان طفيفة جدا من الخلايا في أنسجة القلب. عزلتهم وزراعة يمكن أن يكون صعبا للغاية. هناك ثلاث خطوات حاسمة في هذا البروتوكول. الأ...

نماذج الماوس من مختلف الأمراض القلبية الوعائية واضطرابات التمثيل الغذائي تحمل التغيرات الفسيولوجية والجزيئية التي هي مماثلة لتلك التي وجدت في المرضى. وعلاوة على ذلك، والتعديلات الجينية من الفئران هو أداة قوية تسمح لنا للتحقيق في دور الممرضة من جينات معينة في تطور وتقدم في جميع الأمراض. في الوقت الحاضر، خلية من نوع معين الجينات تدق في أو تتولد الفئران-خارجا بسهولة في العديد من المختبرات وقياس مرنا ومستويات البروتين في أنواع معينة من الخلايا هي الخطوة الأولى في تحديد ما إذا كانت الفئران كانت حقا المعدلة وراثيا. البطانة هي طبقة واحدة رقيقة من الخلايا البطانية (ECS) أن خطوط جدار الأوعية الدموية الداخلية. الخلايا البطانية تلعب دورا حاسما في تنظيم توتر الأوعية الدموية، ونفاذية الأوعية الدموية، وتشكيل الأوعية الدموية الجديدة 1،2. الخلايا البطانية هو السمة المميزة للعديد من الحالات المرضية والتغيرات في وظيفة بطانة الأوعية الدموية يمكن أن يؤدي إلى السيارة المختلفةالأمراض diovascular 3،4. ومن ثم كبيرا لدراسة وظيفة الخلايا البطانية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض. هناك عدة طرق لعزل ECS 5-8 وأسلوب العزل يجب أن يكون الأمثل اعتمادا على الأنسجة والأنواع سوف تستخدم. وذلك لأن ECS من الأنسجة المختلفة عرض على مستوى عال من عدم التجانس فيما يتعلق علامات سطحها والتعبير البروتين 9. العزلة الناجحة من الخلايا البطانية وغالبا ما تكون صعبة وتتطلب قدرا من التدريب والممارسة. وبمجرد تحقيقه، وطريقة العزل المقترحة في هذا البروتوكول يبرهن على أن تكون مستقرة وفعالة. ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو الحصول على الماوس التاجي ECS (MCECs) ذات جودة عالية وكمية. على الرغم من أن كمية الخلايا التي تم جمعها من قلب أقل من الخلايا التي تم جمعها من الأنسجة الأخرى باستخدام تقنيات أخرى، فإن هذا الأسلوب لا يزال يوفر الرهانجودة ثالثا. نقاء من الخلايا البطانية في عدد السكان الناتج أكبر من 90٪. وبالتالي، فإن هذه التقنية سيكون مثاليا للتطبيقات التي تعتمد على الخلايا البطانية معزولة بحتة مثل التصوير الخلية.

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311-10G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher</td><td>SH3026801</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>بيكربونات الصوديوم &nbsp ؛</td><td>سيجما</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D- (+) -جلوكوز &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads عموم ماوس IgG الخرز&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>الأجسام المضادة للفئران CD31</td> BD <td>Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>IFCS &nbsp;</td><td>فيشر</td><td>SH30072.04</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>فيشر</td><td>MT10060-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (بروتياز محايد)</td><td>Worthington Biochemical Corp. / Fisher</td><td>LS02109</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II &nbsp;</td><td>شركة ورثينجتون للكيمياء الحيوية / فيشر</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>الجلسرين &nbsp;</td><td>فيشر</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma</td><td>I3021-50 مل</td><td></td></tr><tr><td>كوكتيل مثبط الفوسفاتيز</td><td>Sigma</td><td>P0044-1ml</td><td></td></tr><tr><td>كوكتيل مثبط البروتياز</td><td>Sigma</td><td>P8340-1 مل</td><td></td></tr><tr><td>الهيبارين & nbsp ؛</td><td>سيجما</td><td>H3149-100KU</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>فيشر / ميدياتك</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>D-Valine</td><td>Sigma</td><td>V1255-5G</td><td></td></tr><tr><td>EGS</td><td>كورنينج</td><td>356006</td><td></td></tr><tr><td>البنسلين / الستربتومايسين</td><td>فيشر / Mediatech</td><td>MT-30-002-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

عزل خلايا الفأر التاجي غشائي

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

الخلايا البطانية خط الجدار الداخلي للأوعية الدموية، وتلعب دورا هاما في تنظيم لهجة الأوعية الدموية، ونفاذية الأوعية الدموية، وتشكيل الأوعية الدموية الجديدة. تورط خلل الخلايا البطانية في تطور وتقدم العديد من أمراض القلب والشرايين بما في ذلك مرض نقص تروية القلب. لدراسة وظيفة وتوصيف الخلايا البطانية التاجية، والعزلة الخلية هي الخطوة الأولى ويتطلب عالية النقاء وكمية لإجراء تجارب لاحقة. يصف هذا البروتوكول وسيلة فعالة لعزل الماوس الكبار الخلايا البطانية التاجية. يتم تشريح قلب فأر والمفروم إلى قطع صغيرة. بعد هضم القلب باستخدام dispase وكولاجيناز الثاني، يتم غسلها الخلايا وحضنت مع حبات مغناطيسية والتي مترافق مع الأجسام المضادة لمكافحة CD31. حبات مع الخلايا البطانية يتم غسلها عدة مرات ونحن على استعداد لاستخدامها في مختلف التطبيقات، بما في ذلك التصوير وexperime البيولوجي الجزيئياليلة. العزلة الفعالة ينتج ما يقرب من 10 4 خلايا في قلب واحد مع أكثر من 90٪ النقاء.

العزلة الناجحة من الخلايا البطانية التاجية من قلب فأر عادة ينتج حوالي 10 4 الخلايا مع أكثر من 90٪ النقاء مع شكل حصاة كبيرة. بالنسبة لعدد السكان نقية من خلايا بطانة الأوعية الدموية، وينبغي اتخاذ الحذر في جميع أنحاء بروتوكول لضمان بيئة معقمة خالية من أي تلوث. ظهور الخلايا ممدود أو خلايا الموسع بين السكان يشير تلوث مع أنواع أخرى من الخلايا، وخلايا العضلات الملساء والخلايا الليفية. يتم تنفيذ البطانية اختبار خلية نقاء من تلطيخ الخلايا مع علام...

هذا البروتوكول جاهز لمشاركة طريقتنا في عزل الخلايا البطانية التاجية للفأر لغرض التصوير أو لإجراء تجارب بيولوجية جزيئية.

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

الهدف العام من هذه التجربة هو الحصول على أعداد كبيرة من الخلايا البطانية التاجية للفئران عالية النقاوة والجودة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال أبحاث القلب والأوعية الدموية. وتكمن الميزة الأساسية لهذه التقنية في أنها تسهل الحصول على إنتاجية عالية من الخلايا البطانية ذات الجودة الجيدة.سيقوم بشرح هذا الإجراء شيزين لو، وهو أخصائي أبحاث، والدكتورة أياكو ماكينو، الباحثة الرئيسية لدينا. قبل الإجراء بمدة تصل إلى أسبوع واحد، أضف 1 mL من منظم CD31 إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL لكل عينة. بعد ذلك، اخلط حبيبات sheep antirad IGG عن طريق السحب والضخ اللطيف باستخدام الماصة، وأضف الحجم المناسب من الحبيبات إلى كل أنبوب.بعد إضافة جميع الخرزات، رُج الأنابيب بقوة 30 مرة وضعها على لوحة مغناطيسية لمدة دقيقة واحدة من الرج. ثم، بينما لا تزال الأنابيب مثبتة على اللوحة، تخلص من المنظم وأضف 1 mL من منظم CD31 الطازج إلى كل أنبوب. أضف 2 µL من الجسم المضاد rad anti-mouse CD31 وضع الأنابيب على جهاز تدوير عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل.في اليوم التالي، انقل الأنابيب تحت غطاء التدفق الصفائحي وضعها مرة أخرى على اللوحة المغناطيسية مع الرج لمدة دقيقة واحدة. ثم استبدل السائل الطافي بـ 1 mL من منظم CD31 الطازج ورج الأنابيب بقوة يدويًا 30 مرة. بعد الغسلة الثالثة، أعِد الأنابيب إلى جهاز التدوير عند درجة حرارة 4 °C.في يوم الإجراء، ابدأ بحقن الحيوان التجريبي داخل الصفاق بـ 0.1 milliliters من الهيبارين لمنع تخثر الدم. وبعد عشر دقائق، قم بتخدير الفأر بحقن 0.01 milliliters من البنتوباربيتال. ثم تأكد من عدم وجود استجابة عند قرص إصبع القدم.بعد إزالة أنسجة القلب والرئة معاً، ضعها في دورق يحتوي على محلول كريبس المنظم (Krebs buffer) واشطف الأنسجة مع الرج اللطيف. ثم انقل الأنسجة إلى طبق قطره ستة سنتيمترات يحتوي على محلول كريبس طازج، واستخدم المقص والملاقط لإزالة فصوص الرئة. الآن، أدخل قسطرة قياس 20 gauge في الشريان الأورطي وقم بغسل الدورة الدموية الإكليلية باستخدام محلول HBSS المضاف إليه الهيبارين.عندما يتم سحب كل الدم، اصنع قطعاً صغيراً في البطين، واشطف القلب بهزه برفق، ثم ضع أنسجة القلب في أنبوب عينات على الثلج. وبعد هضم الأنسجة لتحرير الخلايا البطانية التاجية، قم بترسيب الخلايا وغسلها مرتين باستخدام 5 mL من محلول غسيل منظم. ثم ضع أنبوباً من الخرزات التي تم تحضيرها مسبقاً على الصفيحة المغناطيسية وهز الأنبوب ثلاث مرات لتوزيع الخرزات بالتساوي.بعد الغسلة الثانية، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السائل الطافي دون تعريض الراسب للتشتت، وقم بفك تجمعات الخلايا عن طريق النقر القوي على جدار الأنبوب. بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا في 1 mL من محلول الغسيل مع الخلط اللطيف، وتخلص من محلول CD31 الموجود مع الخرزات. ادمج الخلايا مع الخرزات، ثم انقر على الأنبوب 30 مرة.ثم ضع محلول الخلايا والخرزات على جهاز التدوير عند درجة حرارة 4 °C لمدة 30 دقيقة. وأثناء فترة تحضين الخلايا، قم بتغطية سطح بئر واحد من حجرات الزرع لكل عينة بمحلول الجيلاتين، وضع الحجرات عند درجة حرارة 37 °C لمدة 30 دقيقة. وعندما يتصلب الجيلاتين، قم بإزالة أي محلول هلامي زائد وتجفيف سطح بئر الحجرة.بعد ذلك، انقل الخلايا المقترنة بالخرز إلى اللوح المغناطيسي تحت غطاء التدفق الصفائحي (hood) للرج لمدة دقيقتين، ثم تخلص من محلول الغسيل المنظم. أضف 1 mL من محلول غسيل منظم جديد إلى الخلايا، وارفع الأنبوب من اللوح للرج بقوة 30 مرة، تليها 30 نقرة خفيفة. أعد الأنبوب إلى اللوح للرج لمدة دقيقة أخرى.بعد عملية الرج الأخيرة، أعد الأنبوب إلى اللوح المغناطيسي للرج لمدة دقيقة واحدة أخيرة، واستبدل محلول الغسيل بـ 1 mL من وسط زراعة الخلايا البطانية عند درجة حرارة 37 °C، مضافاً إليه 20% من مصل العجول المدعم بالحديد. قم برج الأنابيب ونقرها 30 مرة أخيرة. ثم استخدم ماصة سعة 1 mL مضبوطة على 500 µL لتحريك الخلايا المتقارنة عشر مرات، وانقل حصصاً مقدارها 500 µL من الخلايا البطانية التاجية إلى كل بئر من آبار غرفة الزرع للحضانة طوال الليل عند درجة حرارة 37 °C.في اليوم التالي، تُغسل الخلايا في وسط الخلايا البطانية المُدعم بـ 10% FBS. ويمكن التأكد من نقاء الخلايا البطانية التاجية المعزولة بهذه الطريقة عن طريق الصبغ الكيميائي النسيجي المناعي ضد علامات سطح الخلايا البطانية، BS lectin و AC LDL، حيث تظهر أكثر من 90% من الخلايا تعبيراً إيجابياً مزدوجاً لكلتا العلامتين في مستنبت نموذجي للخلايا البطانية التاجية للفأر. وبعد هذا الإجراء، يمكن استخدام هذه الطريقة لإجراء تحاليل دم متنوعة، واستقبال مناعي، وتصوير فلوروسنتي للإجابة على أسئلة إضافية، مثل معرفة البروتين الذي يمكن تعديله خلال الحالات المرضية المختلفة.بعد تطوير هذه التقنية، فإنها توفر الأدوات اللازمة للباحثين لتوسيع نطاق أبحاثهم في مجال الخلايا البطانية التاجية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا البطانية التاجية للفئران بكمية وجودة عاليتين. هناك عدة نقاط رئيسية خلال هذا الإجراء.أهم أمر هو الحفاظ على بيئة معقمة طوال عملية العزل. وثانياً، يجب غسل الدم تماماً وفي أسرع وقت ممكن لتجنب تجلط الدم في الشبكة الشعيرية. وثالثاً، يجب قياس الرقم الهيدروجيني pH لجميع المحاليل المنظمة، وخاصة المحلول المنظم CD31.

isolation-of-mouse-coronary-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هنا ، نحن تصف بروتوكول للثقافة العزلة والفئران من خلايا بطانة الأوعية الدموية الرئوية. يضم هذا الأسلوب ميكانيكي والأنزيمية تفارق أنسجة الرئة ، فضلا عن عملية تنقية 2 - خطوة استخدام الألغام المضادة للPECAM - 1 ومعاداة ICAM - 2 الأضداد مترافق إلى حبات المغناطيسي ، والتي تنتج الخلايا البطانية نقية السكان من أصل الاوعية الدموية الدقيقة في معظمها.

العزلة والثقافة في الخلايا البطانية الرئوي من الفئران حديثي الولادة

تعد القدرة على عزل الخلايا البطانية لصمام القلب (VECs) أمرا بالغ الأهمية لفهم آليات تطوير الصمام وصيانته ومرضه.  نصف هنا عزل VECs عن الفئران الجنينية والبالغة Tie2-GFP باستخدام FACS الذي سيسمح بإجراء دراسات تحدد مساهمة VECs في عمليات النمو والمرض.

عزل خلايا الفئران صمام غشائي

تلعب الخلايا البطانية الوعائية دورا مهما في العديد من اضطرابات القلب والأوعية الدموية المهمة. توضح هذه المقالة طريقة بسيطة لعزل الخلايا البطانية وتوسيعها من الشريان الأورطي للفأر دون استخدام أي معدات خاصة. يوفر بروتوكولنا وسيلة فعالة لتحديد الآليات في علم الأمراض الفيزيائية للخلايا البطانية.

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

والغرض من هذا البروتوكول هو للتدليل على تقنيات العزل وثقافة الخلايا الأولية الفئران الأوعية الدموية العضلات الملساء (VSMCs) من الدورة التاجية. مرة واحدة وقد تم عزل VSMCs، ويمكن استخدامها في العديد من تقنيات زراعة القياسية.

عزل الفئران التاجي الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء

Microvascular خلايا بطانية لعضلات الهيكل العظمى (مك) شكل الجدار الداخلي للعضلات الشعيرات الدموية وتنظم على حد سواء، تبادل السوائل/الجزيئات والهجرة من الخلايا (المناعية) بين أنسجة العضلات والدم. عزل مك مورين الأولية، كما هو موضح هنا، يتيح إجراء تحقيقات شاملة في المختبر لوحدة "ميوفاسكولار".

عزل خلايا بطانية Microvascular الابتدائي مورين الهيكل العظمى والعضلات

نقدم بروتوكولًا لعزل الخلايا الأندية والانهوائية التاجية من قلوب الفئران من خلال هضم الأنسجة بالتتابع في عازل للهضم وجمع الخلايا من دورات الطرد المركزي المتكررة وتنقية الخلايا باستخدام الميكروبات CD31 المضادة للفئران.

عزل الخلايا الإندوكاريال والشريان التاجي من الجدار الحر البطيني للقلب الجرذ

هنا نوجز ونوضح بروتوكولا لعزل الخلايا البطانية الجيبية الأولية لكبد الفأر (LSEC). يعتمد البروتوكول على تروية كولاجيناز الكبد ، وتنقية الخلايا غير المتنية عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة ، واختيار الخرزة المغناطيسية CD146. نحن أيضا النمط الظاهري ونوصيف هذه LSECs المعزولة باستخدام قياس التدفق الخلوي والمجهر الإلكتروني الماسح.

عزل وتوصيف الخلايا البطانية الجيبية الأولية للكبد الفأر

نقدم طريقة لعزل الخلايا البطانية والنوى عن تجويف الشرايين السباتية للفئران المعرضة لظروف تدفق مستقرة أو مضطربة لإجراء تجارب omics أحادية الخلية.

عزل الخلايا البطانية عن تجويف الشرايين السباتية للفئران لإجراء تجارب متعددة الخلايا أحادية الخلية

في هذه المقالة ، تم عزل الخلايا البطانية الرئوية الأولية واستزراعها من الفئران حديثي الولادة.

عزل الخلايا البطانية لرئة الفأر الأولية

يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا البطانية للفأر عن البنكرياس الكامل.

عزل الخلايا البطانية البنكرياسية للفأر

تعلم عزل خلايا الفأر التاجي غشائي لأبحاث القلب والأوعية الدموية باستخدام تقنية CD31 والخرز المغناطيسي. هذه الطريقة توفر خلايا عالية النقاوة لدراسة آليات الأمراض القلبية.

عزل خلايا الفأر التاجي غشائي

استكشف المزيد من الفيديوهات