دليل لهيكلة الإضاءة TIRF المجهري بسرعة عالية مع الألوان متعددة

الهدف العام من هذا البروتوكول هو بناء ومحاذاة مجهر إضاءة منظم مناسب للتصوير عالي السرعة للخلايا الحية فائقة الدقة قادر على العمل في أوضاع TIRF والتقسيم البصري بألوان متعددة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية التي لا يمكن الإجابة عليها حاليا باستخدام الفحص المجهري القياسي المحدود للحيود. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي دقة الوقت السريعة مقارنة بتقنيات الفحص المجهري فائقة الدقة الأخرى ، مما يجعلها مناسبة تماما لتصوير العمليات الديناميكية في الخلايا الحية.

على الرغم من أن هذا البروتوكول يصف خطوات إنشاء مجهر TIRF-SIM ، إلا أن الإعداد مرن وسهل التعديل لتنفيذ طرائق التصوير مثل 3D-SIM و SIM متعدد البؤر و SIM غير الخطي. لترتيب ومحاذاة مسار الإثارة لمجهر الإضاءة المنظم ، ابدأ بتحديد مواضع المكونات على الطاولة البصرية كما هو موضح هنا. بعد إدخال أول مرآة ثنائية اللون ، DM4 ، في برج مكعب المرشح لإطار المجهر ، أدخل المرآة ثنائية اللون الثانية ، DM3 ، في حامل مرآة حركية بحجم بوصة مربعة واحدة وضعها على بعد بؤري واحد بعيدا عن عدسة المكثف ، L5. بعد ذلك ، لتحديد الوصول البصري للنظام بدقة ، قم بإزالة العدسة الموضوعية ، OB ، من البرج ، وبدلا من ذلك قم بربط أداة المحاذاة.

بعد ذلك ، استخدم المرآة ثنائية اللون DM3 ومرآة المحاذاة المؤقتة الموضوعة في الموقع النهائي التقريبي ل SLM لتوجيه شعاع مرجعي موزاة من الليزر واحد عبر مركز الفتحات في قرصي المحاذاة. باستخدام ثلاث مرايا ومرآة ثنائية اللون DM2 كما هو موضح هنا ، قم بتوجيه الشعاع من الليزر إلى المرآة المؤقتة. بمجرد تحديد المحور البصري الخشن ، قم بإزالة أداة المحاذاة.

ثم أدخل قزحية في مسار الحزمة قبل أن تدخل جسم المجهر وتوسيطها على الحزمة. قم بإرفاق قطعة من البطاقة البيضاء بفتحة صغيرة تتمركز في المنتصف على القزحية ، ثم أعد إدخال العدسة الموضوعية. بعد ذلك ، قم بإجراء تعديلات زاوية تكرارية على المرايا DM3 ، وفي وضع SLM لتوسيط الانعكاس الخلفي على البطاقة مع الحزمة الواردة.

ثم قم بإزالة العدسة الموضوعية مؤقتا وقم بتمييز بقعة الليزر على السقف لإنشاء موضع مرجعي. أدخل عدسة الأنبوب ، L5 ، بعد بؤري واحد تقريبا من الهدف ، وقم بتثبيتها على مرحلة ترجمة خطية تم تعيينها للترجمة على طول اتجاه الحزمة المرجعية. اضبط موضع عدسة الأنبوب وزاويته بحيث يتم موازاة الشعاع الذي يغادر الهدف وضرب البقعة المرجعية على السقف.

تأكد من أن العدسة متعامدة مع الحزمة عن طريق التحقق مرة أخرى من الانعكاس الخلفي باستخدام القزحية والبطاقة البيضاء. ثم قم بإزالة العدسة الموضوعية وأدخل العدسة الثانية لتلسكوب ترحيل الصورة ، L4. استخدم مرحلة الترجمة الخطية لضبط موضع هذه العدسة وزاويتها للحفاظ على الموازاة ، ولضمان استمرار الحزمة المرجعية في الوصول إلى البقعة المحددة على السقف. استبدل العدسة الموضوعية وأدخل العدسة الأولى للتلسكوب ، L3. اضبط موضع هذه العدسة وزاويتها لضمان الموازاة وعدم الانحراف كما هو موضح سابقا.

بعد تركيب شريحة SLM وفقا لبروتوكول النص ، مع محاذاة العدسات ، أدخل SLM بدلا من المرآة. اضبط موضع SLM بحيث يكون الشعاع المرجعي موجودا في وسط شريحة SLM ، واضبط الزاوية بحيث يمر الشعاع عبر عدستي الترحيل. ثم تحقق من أن الحزمة المرجعية لا تزال متمركزة في المكان المحدد.

قم بتركيب المثبط المتغير للبلورة السائلة ، أو LCVR ، بمحوره السريع عند 45 درجة إلى الاستقطاب الساقط. ثم بعد الانتهاء من محاذاة محور دوار الاستقطاب وفقا لبروتوكول النص ، باستخدام الضوء المرسل عبر العين ، ركز على شبكية وقم بإصلاح العدسة الموضوعية في هذا الموضع. ثم قم بإعداد طبقة أحادية من حبات الفلورسنت عن طريق نشر قطرة من الخرز متعدد الألوان 100 نانومتر على غطاء زجاجي رقم 1.5.

اترك الخرزات حتى تجف لامتصاص الخرزات في الزجاج قبل إعادة غمرها في الماء. باستخدام زيت الغمر ، ضع عينة الخرزة على الهدف. اضبط موضع الكاميرا بدقة بحيث تكون طبقة حبة الفلورسنت في بؤرة التركيز.

بعد إنشاء أنماط صريف ثنائية لبطاقة SIM كملفات نقطية وتحميلها على SLM وفقا لبروتوكول النص ، قم بتحميل برنامج التحكم في SLM وانقر فوق اتصال. في علامة التبويب ذخيرة، انقر فوق تحميل"لفتح ملف الذخيرة، وتحقق من عدد الأوامر الجارية المضمنة في الملف. انقر فوق إرسال إلى مجلس الإدارة"لتحميل ملف الذخيرة إلى SLM.

بعد ذلك ، حدد علامة التبويب الحالة "وأدخل رقم الأمر الجاري". انقر فوق "تحديد" لتغيير ترتيب التشغيل إلى شبكة المحاذاة. أدخل قناعا مكانيا ، أو SM ، مركبا على مرحلة XY في مسار الحزمة في الموضع البؤري ل L3 ، وقم بترجمة موضعه فيما يتعلق بالمحور البصري بحيث يتم تمرير الأوامر الأولى المطلوبة فقط.

مباشرة بعد المرشح المكاني ، لن يكون هناك سوى حزمتين دائريتين. تحقق من صورة طبقة حبة الفلورسنت على الكاميرا. إذا لم تكن الحزمتان الدائريتان متداخلتين كما هو موضح هنا، فقم بتغيير موضع مستوى العينة، واضبط العدسة الموضوعية وموضع الكاميرا بشكل متكرر.

بعد ضبط التركيز الدقيق وضبط مستوى العينة وفقا لبروتوكول النص ، قم بتأكيد إضاءة TIRF عن طريق التصوير ، على سبيل المثال ، محلول من صبغة 10 ميكرومولار rhodamine 6G عن طريق التركيز على الصبغة. إذا كانت الحزمتان تتصاغران بزاوية TIRF الصحيحة ، فستكون الجزيئات المفردة مرئية بدون خلفية عالية ، وستكون حواف الفتحة الدائرية في بؤرة التركيز. يمكن إجراء تعديلات دقيقة على موضع الحزم عن طريق ضبط المرآة ثنائية اللون DM3.

لمزامنة النظام ومعايرته، ضع عينة أحادية الطبقة على الهدف، وقم بالتركيز عليها. استخدم برنامج التحكم SLM لبرمجة SLM لعرض كل صورة من صور الإزاحة ثلاثية الطور بدورها لاتجاه النمط الأول. ثم قم بالتبديل إلى تشغيل الترتيب الرابع من ذخيرة المثال.

في برنامج الاستحواذ ، قم بتكوين الكاميرا لفترة التعرض العالمية عن طريق اختيار خصائص الكاميرا المتقدمة "وتعيين نوع مشغل الإخراج 1" إلى إيجابي ، ونوع مشغل الإخراج 2 "إلى سلبي. في جزء التسلسل ضمن نوع المسح الضوئي، حدد سجل القرص الثابت، وقم بتعيين عدد الإطارات إلى ثلاثة. ثم انقر فوق "ابدأ" للحصول على ثلاثة إطارات.

سيتغير نمط SLM عند كل تعرض. بعد استدعاء النظام وفقا لبروتوكول النص ، في برنامج التحكم SLM ، قم بتبديل ترتيب تشغيل SLM إلى سلسلة كاملة من تسع صور شبكية ثنائية مطلوبة ل TIRF-SIM. هذا هو ترتيب التشغيل صفر في مرجع المثال.

بعد الحصول على تسع صور لعينة الخرزة ، في جزء التسلسل من برنامج الكاميرا ، حدد سجل القرص الصلب "كنوع المسح الضوئي ، وقم بتغيير عدد الإطارات إلى تسعة. ثم انقر فوق ابدأ" للحصول على الصور. أخيرا ، ضمن حفظ الصور المخزنة مؤقتا ، اختر TIFF كنوع الصورة ، وانقر فوق موافق. أعد بناء صورة فائقة الدقة وفقا لبروتوكول النص.

كما هو موضح هنا ، تم تصوير حبات الفلورسنت متعددة الألوان بقطر 100 نانومتر لمقارنة TIRF القياسي ب TIRF-SIM. من الواضح أن TIRF-SIM كان لديه دقة جانبية أعلى بكثير مقارنة ب TIRF. الدقة المقدرة للمجهر هي 90 نانومتر و 120 نانومتر ل 488 و 640 نانومتر TIRF-SIM ، على التوالي.

هذا يتوافق مع تحسن مزدوج في الدقة الجانبية لكلا الطولين الموجيين مقارنة بالحالة المحدودة للحيود النظري. كما هو موضح هنا ، تم تشكيل ألياف الأميلويد المسماة بالفلورسنت في المختبر واستخدمت أيضا كعينة اختبار لإظهار الدقة المضاعفة. تعتبر الهياكل الخلوية الفرعية ذات التباين العالي، مثل الأنابيب الدقيقة المسماة emGFP أو LifeAct-GFP مثالية لتصوير TIRF-SIM، وتنتج صورا عالية التباين وفائقة الدقة.

يتيح تصوير TIRF-SIM باستخدام الإعداد الموضح مراقبة مجموعة سكانية فرعية من الأنابيب الدقيقة الموجودة بالقرب من قشرة الخلية القاعدية ، ويمكن رؤية بلمرة الأنابيب الدقيقة وإزالة البلمرة بمرور الوقت. تفتقر عينات التباين المنخفض بدون هياكل منفصلة إلى معلومات عالية الدقة باستثناء حواف غشاء البلازما ، وبالتالي فهي دون المستوى الأمثل لتصوير TIRF-SIM. أخيرا ، يعد تباين التعديل العالي ضروريا لتصوير بطاقة SIM بنجاح.

كما هو موضح هنا ، يسمح تحويل فورييه للصورة المعاد بناؤها بتصور وظيفة النقل البصري لبطاقة SIM. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن إكمال هذه التقنية في حوالي أسبوع واحد ، إذا تم الحصول على جميع الأجزاء الضرورية. عند محاولة هذا الإجراء ، يجب على المرء أن يكون على دراية بأهم المشكلات لتنفيذ TIRF-SIM بنجاح.

أولا ، المحاذاة الدقيقة للحزم ضرورية. قد يكون هذا صعبا ، حيث يجب أن تكون موجودة على حواف فتحة العدسة الشيئية. ثانيا ، من الأهمية بمكان أن يتم تدوير حالة استقطاب الضوء مع النمط.

بدون هذا ، سيكون تباين نمط العينة منخفضا وسيكون بناء الصورة اللاحق مستحيلا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لأهم الخطوات في بناء ومحاذاة مجهر TIRF-SIM القائم على SLM. لا تنس أن العمل مع ليزر الفئة 3B يمكن أن يكون خطيرا للغاية.

يجب الحفاظ على طاقة الليزر عند مستويات آمنة للعين أثناء إجراء عملية المحاذاة مع هدف TIRF في مكانه.