إعداد 3D الهلام الكولاجين وMicrochannels لدراسة التفاعلات 3D في فيفو

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد مصفوفات كولاجين ثلاثية الأبعاد محاذاة وعشوائية ، لغرض مراقبة هجرة الخلايا أو العمليات الخلوية الأخرى في سياق بيئة ثلاثية الأبعاد. تم تصميم هذه الطريقة لالتقاط ميزات الكولاجين التي نجدها في الأنسجة الحقيقية ، والتي يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية مثل الآليات التي تستخدمها الخلايا للتعرف على مصفوفة محاذاة أو عشوائية خارج الخلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكنك التلاعب بتنظيم البيئة ثلاثية الأبعاد وخلايا الصورة بداخلها ويمكنك القيام بذلك بشكل فعال من حيث التكلفة باستخدام المعدات المتوفرة بشكل شائع.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنهم لا يخلطون محلول الكولاجين ومخزن التحييد جيدا بما فيه الكفاية ويسحبون الكولاجين عبر القنوات بشكل غير متسق. سيوضح هذا الإجراء بريان بوركل ، وهو عالم كبير في مختبري. للبدء ، اخلطي الكولاجين ومحلول HEPES جيدا قبل إضافة الخلايا والوسائط لضمان تحييد الكولاجين بشكل صحيح.

بعد ذلك ، أضف الخلايا والوسائط إلى خليط الكولاجين المحايد وضعها على الجليد كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. قم بإخراج الخليط المثلج البارد في سطح معقم غير مزرعة أنسجة لتقليل التصاق ونمو الخلايا خارج هلام الكولاجين. استخدم ماصة لتوزيع المحلول بالتساوي.

اترك الجل يتبلمر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة تقريبا. بعد ذلك ، قم بتغطية المواد الهلامية ، وانقلها إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 45 إلى 60 دقيقة إضافية لإنهاء البلمرة. عند البلمرة ، سوف يتحول الجل إلى معتم.

بمجرد البلمرة ، أضف ملليلترتين إلى ثلاثة ملليلترات من الوسائط. بعد ذلك ، حرر المواد الهلامية من جوانب البئر عن طريق تشغيل 200 ماصة حول محيط البئر. حرك الطبق برفق لتحرير الجل من السطح السفلي.

من أجل إنشاء قنوات دقيقة PDMS لمحاذاة مصفوفات الكولاجين. قم أولا بإعداد سيد السيليكون SuA ، باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة القياسية الموضحة في مكان آخر. بعد ذلك ، استخدم عصا حرفية لخلط 20 جراما من قاعدة المطاط الصناعي مع 2 جرام من عامل المعالجة في كوب يمكن التخلص منه.

بمجرد خلطه جيدا ، قم بإزالة خليط PDMS عن طريق وضع الكوب القابل للتصرف في غرفة مفرغة تحت ضغط فراغ يبلغ 550 ملم من الزئبق. ينزع الخليط لمدة ساعة إلى ساعة ونصف. أثناء تفريغ PDMS ، قم بإعداد سيد السيليكون عن طريق وضع ورقة نظيفة من فيلم الشفاف على لوح تسخين متبوعا بسيد السيليكون.

تأكد من أن قالب القناة الصغيرة متجها لأعلى. بعد ساعة إلى ساعة ونصف ، قم بإزالة PDMS منزوع الغاز من غرفة التفريغ. اسكب PDMS ببطء في وسط السيد واترك الجاذبية تنتشر بالتساوي.

بعد ذلك ، قم بلف ورقة ثانية من فيلم الشفاف بعناية أعلى سيد السيليكون و PDMS لتجنب فقاعات الهواء. ضع ورقة مطاطية برفق فوق الشفافية ، متبوعة بورقة 1/8 بوصة من الأكريليك ، ثم أضف أول ثلاثة أوزان عشرة أرطال فوق لوح الأكريليك. في البداية ، سوف يطفو الوزن الأول ، ويسمح له بالاستقرار والاستقرار قبل الشروع في لوحي الوزن المتبقيتين.

عندما تكون جاهزا للمتابعة ، اضبط لوحا ساخنا على 70 درجة مئوية وقم بمعالجة PDMS لمدة أربع ساعات. بمجرد المعالجة ، اترك PDMS يبرد لمدة ساعة إضافية على الأقل ، ثم قم بتقشير طبقة الشفافية العلوية للرقاقة بعناية. أخيرا ، قم بإزالة القنوات بالملقط.

ضع القنوات رأسا على عقب على فيلم شفاف ونظيف جديد ونظف جميع المنافذ باستخدام حركة دائرية ملقط حاد. قم بإزالة أي أجزاء من PDMS تنفصل. بعد ذلك ، ضع قطعة من شريط التعبئة على المقعد ، بحيث يكون الجانب اللاصق لأعلى واضبط قناة PDMS على الجانب لأسفل أعلى الشريط.

اضغط لأسفل على القنوات ذات الطرف الدائري لزوج من الملقط لضمان الاتصال الجيد. قم بإزالة القنوات وكرر هذه العملية على كلا الجانبين حتى تتم إزالة كل الحطام المرئي. بعد ذلك ، انقل قنوات PDMS النظيفة والجاهزة إلى أنبوب مخروطي 50 مليلتر مملوء بنسبة 70٪ من الإيثانول.

بتدوير القنوات بأقصى سرعة لمدة 30 ثانية ، ثم استبدل المحلول بالإيثانول الطازج بنسبة 70٪. باستخدام تقنيات معقمة ، انقل جانب قناة PDMS لأعلى ، إلى طبق نظيف ومعقم. بعد ذلك ، تعالج الأشعة فوق البنفسجية القنوات حتى يتبخر الإيثانول.

بمجرد أن تجف ، اقلب القنوات على غطاء زلة أو طبق زجاجي سفلي واضغط عليها لأسفل على الزجاج لعمل ختم جيد. أضف رقعة من PDMS المعقمة لتغطية وإغلاق الجزء الأوسط من القنوات واترك الإعداد يجف تماما قبل المتابعة. بعد ذلك ، ضع قطرة 100 ميكرولتر من محلول كولاجين 10 ميكروغرام لكل مليلتر في الجزء العلوي من القناة واسحبها عبر القناة باستخدام فراغ.

احتضان القنوات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ثم انقل القنوات ، التي لا تزال مملوءة بمحلول طلاء الكولاجين إلى الثلاجة. قم بتبريد الإعداد لمدة 15 إلى 30 دقيقة تقريبا ثم استخدم شفاطة أو ماصة لإزالة محلول طلاء الكولاجين من القنوات. ابدأ بتحييد محلول الكولاجين وتخفيفه بوسائط الخلية واحتضانه على الثلج لمدة 15 دقيقة.

ثم ضع 120 إلى 150 ميكرولترا من محلول الكولاجين في المنفذ A من قناة مبردة مسبقا. بعد ذلك ، قم بتوصيل ماصة سعة 25 مليلتر بخط تفريغ وضعها فوق المنفذ C. استخدمها لسحب الخليط من خلال حركة واحدة موحدة ، وتوقف بمجرد وصول الكولاجين إلى النهاية. الخطوة الوحيدة الأكثر أهمية لتوليد مصفوفات عشوائية هي سحب الكولاجين ببطء عبر القناة.

إذا تم سحبها بسرعة كبيرة ، فسيؤدي ذلك إلى زيادة المحاذاة في جزء القناة أو في جميع أنحاء القناة. قم بإزالة أي محلول زائد بعناية من مناطق المنفذ ثم ضع بقع PDMS معقمة فوق كلا المنفذين ، A و C. بعد دقيقتين إلى ثلاث دقائق ، قم بإزالة رقعة PDMS المركزية التي تغطي المنفذ B وأضف اثنين إلى ثلاثة فضلات صغيرة من الخلايا بتركيز واحد إلى ثلاثة ملايين خلية لكل مليلتر في المنفذ المركزي. اترك الجل وقتا للبلمرة جزئيا في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة أخرى ثم انقل الحاضنة إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة إضافية.

بمجرد البلمرة ، قم بإزالة أغطية منفذ PDMS وإضافة وسائط لتغطية القناة بالكامل. هنا تم وضع 50،000 أربع خلايا T في 2 مجم / مل أو 3.5 مجم / مل جل كولاجين لمدة 5 أيام. الخط الأول للخلايا التائية الأربعة هو خط سرطان Med Aesthetic شديد الانقباض ولكنه قادر فقط على تقلص الجل عالي الكثافة بنسبة 10٪ تقريبا من المواد الهلامية منخفضة الكثافة المتوافقة مع 57٪ خلال نفس الإطار الزمني.

يتم تعديل درجة محاذاة الكولاجين من خلال معدل تدفق الكولاجين بحيث ينتج عن معدل تدفق الكولاجين العالي محاذاة أفضل. يعزز استخدام القنوات الضيقة إلى جانب ضغوط الفراغ العالية محاذاة شبكة الكولاجين ، بينما تولد القناة الأوسع المستخدمة جنبا إلى جنب مع ضغوط الفراغ المنخفضة مصفوفات عشوائية. بمجرد إتقانها ، يمكن صب المواد الهلامية أو قنوات الكولاجين في غضون ساعتين ونصف إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إعداد المكونات قبل البدء. بمجرد أن تبدأ العمل مع الكولاجين ، تحتاج إلى العمل بسرعة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية ثلاثية الأبعاد ، لاستكشاف التصاق الخلايا والهجرة والغزو إلى بيئات ثلاثية الأبعاد خارج الخلية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية صب المواد الهلامية الكولاجين ذات الكثافات المختلفة وكيفية توليد مصفوفات الكولاجين العشوائية والمحاذاة.