جيل المحددة والمسوخ Markerless في أنواع السيانوبكتيريا نموذج

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار نظام لتوليد طفرات غير مميزة في أنواع Synechocystis البكتيرية الزرقاء PCC6803 والطفرات المميزة في أنواع Synechococcus PCC7002. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الوراثة البكتيريا الزرقاء. مثل كيفية إدخال تغييرات الكروموسومات في سلالة.

عن طريق إدخال جين مقاومة للمضادات الحيوية ، متبوعا بإزالة لاحقة لهذا الكاسيت ، باستخدام علامة سلبية قابلة للتحديد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن التلاعب بالسلالات وراثيا بشكل متكرر. السماح بإدخال أكبر عدد ممكن من التناوب في سلالة حسب الرغبة.

بعد تحضير الوسائط ، سلالات البكتيريا الزرقاء والبلازميدات ، وفقا لبروتوكول النص. قم بإعداد مزرعة جديدة عن طريق تلقيح حلقة مليئة بخلايا البكتيريا الزرقاء ، في 30 إلى 50 ملليلتر من وسط BG11. قم بزراعة المزرعة في الضوء عند 30 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام ، إلى OD7500 ، أي ما يعادل 0.2 إلى 0.6.

بعد الحضانة ، قم بعمل جهاز طرد مركزي من واحد إلى ملليلترين من المزرعة عند 2 ، 300 جرام لمدة خمس دقائق. ثم بعد التخلص من المادة الطافية ، استخدم وسيط BG11 لغسل الكريات مرة واحدة ، مع سحب العينة برفق لإعادة تعليق الخلايا. نظرا لأن الدوامة قد تؤدي إلى فقدان الشوابق ، وهي ضرورية لامتصاص الحمض النووي.

بعد تكوير الخلايا مرة أخرى ، وإزالة المادة الطافية ، أضف وسيط BG11 إلى الحجم النهائي البالغ 100 ميكرولتر ، وانقل الخلايا إلى أنبوب سفلي دائري سعة 14 ملليلترا. بعد ذلك ، أضف 1 ميكروغرام من البلازميد A المحضر مسبقا إلى الخلايا. واضغط برفق للخلط.

ثم ضع الأنابيب أفقيا في الحاضنة عند 30 درجة مئوية ، واحتضنها لمدة أربع إلى ست ساعات. بعد الحضانة ، انشر كميات من خليط الحمض النووي البلازميد لزراعة الخلايا على ألواح أجار BG11 بدون مضادات حيوية. وتحتضن عند 30 درجة مئوية.

بعد حوالي 24 ساعة ، قم بإعداد محلول أجار بنسبة 0.6٪ في الماء الذي يحتوي على الكاناميسين. واتركه يبرد إلى 42 درجة مئوية. ثم أضف 2.5 إلى ثلاثة ملليلتر إلى حواف ألواح الثقافة وقم بإمالة اللوحة ، بحيث يشكل المحلول طبقة أجار علوية متساوية على السطح.

احتضان الصفائح لمدة سبعة أيام تقريبا حتى تكون المستعمرات مرئية. ثم قسم أجار BG11 الطازج بالإضافة إلى لوحة الكاناميسين إلى ستة قطاعات. واستخدم عود أسنان غير حاد لإخراج المستعمرات الفردية.

لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، لتأكيد خروج المغلوب الملحوظ ، قم بنقل كمية صغيرة من الخلايا إلى أنبوب يحتوي على 50 ميكرولتر من الماء ، وحوالي 20 425 إلى 600 ميكرومتر من الخرز الزجاجي. رج الخلايا والخرز عند حوالي 2,000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق ، قبل الدوران عند 15،700 جم لمدة خمس دقائق. ثم استخدم خمسة ميكرولترات من المادة الطافية لتحضير تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل 50 ميكرولتر مع مقدمات الحمض النووي.

للتحقق من صحة الطفرات ، بعد تصميم الاشعال وفقا لبروتوكول النص ، تضخيم المنتج باستخدام البرنامج التالي ، وتضمين عنصر تحكم من النوع البري. من خلال gelelektroforeses ، تحقق من النمط الجيني لمحولات الضربة القاضية. يظهر نطاقا من حوالي أربعة أزواج كيلو قاعدة ويفتقر إلى النطاق من النوع البري.

راجع بروتوكول النص لمزيد من التفاصيل. إذا كان الشريط من النوع البري لا يزال موجودا ، فأعد الضغط على اللوحة الجديدة وكرر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). كرر عملية التحقق حتى يتم فصل الطفرة ، ولا يلاحظ أي نطاق من النوع البري في تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

بالنسبة للسلالة التي تظهر ملفا شخصيا متحولا ملحوظا ، أعد خطها على لوحة جديدة لاستخدامها في إنشاء ضربة قاضية غير مميزة. لتوليد طفرات Synechocystis غير المميزة ، قم بإعداد ثقافة جديدة للضربة القاضية الملحوظة عن طريق تلقيح الحلقة المليئة بالخلايا إلى 30 إلى 50 مل من وسط BG11. قم بزراعة المزرعة لمدة يومين إلى ثلاثة أيام إلى OD750 ، أي ما يعادل 0.2 إلى 0.6.

جهاز طرد مركزي 10 ملليلتر من المزرعة عند 2 ، 300 جم لمدة خمس دقائق وتخلص من المادة الطافية. ثم نحن BG11 وسيط لغسل الخلايا بلطف. بعد إضافة BG11 إلى الحجم النهائي البالغ 200 ميكرولتر ، ونقل الخلايا إلى أنبوب سفلي دائري سعة 14 مليلتر ، أضف 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد B إلى الخلايا ، واضغط برفق للخلط.

ثم ضع الأنابيب أفقيا في الحاضنة ، واحتضن لمدة أربع إلى ست ساعات. بعد الحضانة ، أضف 1.8 مل من وسط BG11 واحتضان العينات لمدة أربعة أيام مع الرج. هذا وقت كاف للسماح بحدوث إعادة التركيب في نسخ الكروموسومات المتعددة.

اللوحة 50 و 10 و 1 ميكرولتر من الثقافة المحولة على BG11 بالإضافة إلى 5٪ من ألواح أجار السكروز وتحتضن لمدة سبعة أيام تقريبا لتوليد مستعمرات مفردة. بعد ذلك ، باستخدام عود أسنان غير حاد ، قم بتفقيس 30 إلى 50 مستعمرة فردية على ألواح BG11 plus kanamycin. ثم قم بالتصحيح على BG11 بالإضافة إلى 5٪ سكروز.

المستعمرات التي تنمو على BG11 بالإضافة إلى السكروز ، ولكن ليس على أطباق الكاناميسين هي ضربات قاضية محتملة غير مميزة. من المحتمل أن تكون المستعمرات التي تنمو على كلا الصفيحتين مقاومة للسكروز بسبب طفرة في جين sacB. باتباع طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، الموضحة سابقا في هذا الفيديو ، تحقق من الضربات القاضية غير المميزة ، والتي ستنتج شريطا هلاميا يتوافق مع حجم النوع البري مطروحا منه المنطقة المحذوفة.

إذا أظهرت السلالة مظهرا متحورا غير مميز ، فأعد خطها على أجار BG11 الطازج بدون مضادات حيوية. لتخزين السلالات على المدى الطويل ، قم بإعداد ثقافة جديدة للسلالة عن طريق تلقيح حلقة مليئة بالخلايا في 30 إلى 50 مل من وسط BG11. قم بزراعة المزرعة لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام إلى OD750 يساوي 0.4 إلى 0.7.

بعد استخدام BG11 لغسل الخلايا مرة واحدة ، أعد تعليق الحبيبات في ما يقرب من ملليلترين من BG11. أضف 0.8 مل من الخلايا المركزة إلى أنبوب واحد. ثم أضف 0.2 مل من الجلسرين المعقم بنسبة 80٪.

أضف إلى أنبوب آخر 0.93 مل من الخلايا المركزة و 0.07 مل من DMSO. قم بتخزين كلا الأنبوبين عند سالب 80 درجة مئوية. لإحياء السلالات ، قم بإزالة الأنبوب واستخدم عود أسنان غير حاد لكشط بعض الخلايا على صفيحة أجار بدون مضادات حيوية.

ثم استخدم حلقة معقمة لإخراج الخطوط كالمعتاد. يوضح هذا الشكل أمثلة على البلازميدات A و B المستخدمة لتوليد طفرات الحذف. في كل حالة ، تكون مناطق الألواح الخشبية الخمس الرئيسية والثلاثية حوالي 900 إلى 1,000 زوج أساسي.

البلازميد ب ، يمكن أن يحتوي أيضا على شريط جيني بين المناطق الخمسة الأولية والثلاثة الأولية تقريبا زوج كيلو قاعدة واحد يحيط بالمناطق. أو نسخة معدلة من التسلسل الجيني الأصلي. عند التحول مع البلازميد أ ، ستظهر عدة مئات من المستعمرات على طبق بعد سبعة إلى 10 أيام.

إذا كانت الجينات غير ضرورية وأظهرت الطفرات نموا ، على غرار السلالة البرية ، فيجب أن تحتوي جميع الكروموسومات على تسلسل مدرج npt1 / sacB ، على النحو المحدد عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). إذا كانت الجينات غير ضرورية ، وتنمو الطفرات ببطء ، فإن عدة جولات من إعادة الخطوط مع زيادة تركيزات الكاناميسين ، ضرورية للحصول على طفرة ملحوظة منفصلة. إذا لم يتم الحصول على طفرة ملحوظة عند إعادة الخطوط ، فمن المحتمل أن يكون الجين ضروريا للبقاء على قيد الحياة.

غالبية المستعمرات الفردية ، التي تم الحصول عليها من التحول باستخدام البلازميد B ، ستكون حساسة للكاناميسين ومقاومة للسكروز. كما هو موضح هنا ، يظهر تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للمنطقة المستهدفة في هذه المستعمرات أن ما يقرب من 100٪ من ملف تعريف الطفرة غير المميز. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعات على مدى ستة أسابيع إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام تقنية معقمة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس إنتاج الأكسجين ، أو قياس الطيف الكتلي لكروماتوغرافيا الغاز ، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل قياس معدلات التمثيل الضوئي أو إنتاج المستقلب. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الوراثة البكتيريا الزرقاء.

لاستكشاف العمليات البيوكيميائية والفسيولوجية الرئيسية في هذه الشعبة ، والسلالات التنموية للأغراض الصناعية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء ضربة قاضية غير مميزة في أنواع Synechococcus PCC6803.