تطوير متليفة الكبد نموذج الناجم عن الإيثانول في الزرد لدراسة السلف بوساطة الخلايا الكبدية التجديد

الهدف العام من هذا البروتوكول هو إنشاء نموذج الكبد الليفي الناجم عن الإيثانول في أسماك الزرد وإجراء فحوصات كيميائية باستخدام هذا النموذج. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تجديد الكبد. مثل الآليات الجزيئية والخلوية لكيفية تجدد خلايا الكبد في الكبد الليفي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها فعالة من حيث التكلفة وموفرة للوقت في الفحص الكيميائي vevo. علاوة على ذلك ، يمكن إجراء تحليل مفصل للدورة الزمنية من خلال تصور خلية واحدة. سيوضح الإجراء ميانبو هوانغ ، باحث ما بعد الدكتوراه ، وجين شو ، طالب دراسات عليا من المختبر.

بعد تحضير الكواشف وفقا لبروتوكول النص ، قم بإعداد خزانات تزاوج مع فواصل باستخدام أسماك الزرد البالغة المعدلة وراثيا التي تحتوي على بروتين ربط الأحماض الدهنية 10a: CFP-NTR مع Tp1: mCherry و Tg (hand2: EGFP) أسماك الزرد. في صباح اليوم التالي ، بعد ساعتين من إزالة الفواصل ، قم بحصاد الأجنة عن طريق تصفية مياه النظام ونقل الأجنة إلى أطباق بتري 100 ملم تحتوي على وسط الجنين. بعد 56 ساعة من الإخصاب ، أضف 1.5 في المائة من الإيثانول إلى الأجنة.

استخدم غلافا بلاستيكيا لتغطية الألواح لمنع تبخر الإيثانول. ثم احتضن عند 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. قم بإعداد MTZ طازج 15 مللي مولار ووسط جنين مع 0.1 في المائة DMSO وأضف الإيثانول إلى التركيز النهائي البالغ 1.5 في المائة.

بعد ذلك ، عند 80 HPF ، عالج الأجنة المصنفة ب 20 مل من محلول الإيثانول MTZ لكل طبق بتري. استخدم غلافا بلاستيكيا لتغطية الألواح لمنع تبخر الإيثانول وتغطيته بورق الألمنيوم للحماية من الضوء. ثم احتضن عند 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي ، راقب الأجنة تحت مجهر epifluorescent باستخدام مرشح CFP وتكبير 80x لفرز اليرقات مع استئصال شبه كامل لخلايا الكبد. لإجراء الشاشات الكيميائية ، قم بإزالة ألواح الآبار البالغ عددها 96 التي تحتوي على عشرة مخزونات كيميائية مللي مولار في DMSO من الفريزر سالب 80 درجة. استخدم رقائق الألومنيوم لتغطية الألواح لمنع التدهور الضوئي للمواد الكيميائية وذوبان الجليد مع التأرجح اللطيف في درجة حرارة الغرفة.

في أنابيب سعة 1.5 مليلتر ، قم بإعداد المحاليل الكيميائية عن طريق تخفيف خمسة ميكرولترات من محاليل مخزون عشرة ملليمولار مع مليلتر واحد من وسط الجنين إلى تركيز نهائي يبلغ 50 ميكرومولار. بعد ذلك ، انقل خمس يرقات لكل بئر مع استئصال الخلايا الفردية شبه الكامل إلى 24 لوحة بئر مملوءة بوسط الجنين. ثم قم بإزالة وسط الجنين وأضف 500 ميكرولتر من المحاليل الكيميائية لكل بئر.

باستخدام ورق الألمنيوم ، قم بتغطية الألواح واحتضان اليرقات عند 28 درجة مئوية لمدة 50 ساعة. بعد الحضانة ، لاحظ عدد و / أو شدة خلايا الكبد التي تعبر عن CFP تحت مجهر epifluoesent بتكبير 80x. صور اليرقات الحية بأعداد محسنة أو مخفضة و / أو شدة الخلايا الفردية التي تعبر عن CFP.

قم بإعداد تزاوج من أسماك الزرد المعدلة وراثيا التي تحتوي على بروتين ملزم للأحماض الدهنية 10a: CFP-NTR مع TP1: mCherry ورفع اليرقات المصنفة إلى عمر ستة إلى 12 شهرا. استخدم شبكة لنقل أسماك الزرد المعدلة وراثيا البالغة إلى خزانات التزاوج. قم بإعداد الإيثانول الطازج بنسبة واحد في المائة في مياه النظام ثم استخدم 500 مل من المحلول لاستبدال مياه النظام في خزانات التزاوج.

احتضان الخزانات عند 28 درجة مئوية لمدة 72 ساعة ، ونقل الأسماك إلى محلول الإيثانول الطازج وإزالة أي أسماك ميتة يوميا أثناء الحضانة. قم بإعداد محلول MTZ الطازج بسعة عشرة مللي مولار في مياه النظام بنسبة 0.1 في المائة DMSO ، ثم أضف 500 مل من محلول MTZ الدافئ مسبقا إلى الأسماك في خزانات التزاوج سعة لتر واحد. استخدم رقائق الألومنيوم لتغطية الخزانات.

احتضان عند 28 درجة مئوية لمدة ثماني ساعات وقم بتحليله وفقا لبروتوكول النص. بعد التخدير وفقا لبروتوكول النص ، قم بتعريض أعضاء الجهاز الهضمي باستخدام المقص لقطع الجلد وتسطير العضلات على طول البطن من الزعنفة الشرجية إلى الجرعة. ثم اقطع للخلف على طول جانب السمكة مرة أخرى إلى الزعنفة الشرجية.

ضع السمك في أنبوب مخروطي الشكل سعة خمسة عشر ملليلترا واستخدم PBS للغسيل مرة واحدة. ثم قم بإزالة PBS وأضف أربعة ملليلتر من الفورمالديهايد الطازج بنسبة ثلاثة بالمائة في مخزن PEM. احتضن عند أربع درجات مئوية طوال الليل لإصلاح السمك.

في اليوم التالي ، بعد غسل العينات وفقا لبروتوكول النص ، قم بقطع المريء لتشريح الأمعاء بأكملها بالكبد من تجويف الجسم. ثم ضع أعضاء الجهاز الهضمي في قالب تقطيع واستخدم أربعة بالمائة من الاغاروز ذوبان منخفض لتضمين الأنسجة. بعد ذلك ، قم بقص الكتلة إلى شكل شبه منحرف وألصقها بالقاعدة.

ثم استخدم اهتزاز وبدءا من الطرف الداخلي للأنسجة ، قم بتقطيع العينات إلى أقسام عرضية على فترات خمسين ميكرومتر إلى PBS المثلج. استخدم فرشاة الرسم رقم واحد لنقل الأقسام إلى لوحة بستة آبار مع PBS. بعد تلطيخ الأقسام وفقا لبروتوكول النص ، استخدم فرشاة الرسم رقم واحد لنقل الأقسام برفق إلى شرائح زجاجية.

استخدم kimwipes لإزالة PBS الزائد قبل إضافة قطرة من وسط التثبيت وزلة الغطاء. ثم استخدم طلاء الأظافر لإغلاق زجاج الغطاء. أخيرا ، باستخدام نظام متحد البؤر مزود بعدسة زيت 40x 1.3 NA ، التقط صور Z-Stack بقوة 20 إلى 50 بالمائة وفواصل ميكرومتر واحدة.

يوضح هذا الشكل أن اليرقات المعالجة بالإيثانول MTZ تطور انحناء تصاعدي للجذع والذيل ، وورم القلب ، والفشل في تضخيم مثانة السباحة. كما هو موضح هنا ، لم تظهر كبد التحكم المعالج ب DMSO أي ترسب كولاجين شظوي من النوع الأول. في حين أن الكبد المعالج بالإيثانول MTZ أظهر تراكم الكولاجين من النوع الأول في 25 و 50 ساعة بعد الاستئصال.

بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع الكبد الخاضع للرقابة المعالج ب DMSO ، زاد عدد HSC واعتمد شكلا يشبه الأرومة العضلية يفتقر إلى العمليات السيتوبلازمية في الكبد المتجدد المعالج بالإيثانول. يوضح هذا الشكل تطور نموذج الكبد الليفي الناجم عن الإيثانول في أسماك الزرد البالغة المعالجة بالإيثانول بنسبة واحد بالمائة متبوعا ب MTZ. من تحليلات الدورة الزمنية هذه ، لوحظ ارتفاع كبير في ترسب الكولاجين من النوع الأول في الإيثانول MTZ المعالج للكبد المتجدد بعد يومين وثلاثة وأربعة أيام بعد الاستئصال ، مقارنة بالكبد المعالج ب DSMO.

في تجربة الفحص الكيميائي هذه ، تم استئصال خلايا الكبد في وجود 1.5 في المائة من الإيثانول و 15 مليمولار MTZ. ثم تعرضت اليرقات للمواد الكيميائية لمدة 50 ساعة. عزز عدد من ناهضات wint ، مثل مثبطات سينسيز كيناز الجليكوجين -3 ومنشط wint ، تجديد خلايا الكبد مقارنة ب DMSO.

تشير هذه البيانات إلى أن هذا النموذج الليفي المستدام يوفر أداة لا تقدر بثمن لاكتشاف الجزيئات الصغيرة التي تعزز تجديد خلايا الكبد. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أسبوع واحد إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحقيق استئصال شبه كامل لخلايا الكبد والحفاظ على تركيز الإيثانول طوال العملية.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن اختبار كفاءة المركبات الكيميائية المحددة في نماذج إصابات الكبد في الثدييات. بعد تطويرها ، يمكن لهذه التقنية أن تفتح طرقا جديدة في مجال علاج التجديد الخلوي لاستكشاف الاكتشاف المحتمل لاستراتيجيات علاجية جديدة لمرضى الفشل الكبدي المزمن. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطوير نموذج الكبد الليفي الناجم عن الإيثانول في أسماك الزرد وكيفية إجراء الشاشات الكيميائية.

لا تنس أن العمل مع الفورمالديهايد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء القفازات والتعامل مع الكاشف في غطاء الدخان الكيميائي ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.