إعداد وتحليل في المختبر ثلاثة الثدي الأبعاد سرطان البدائل

الهدف العام لهذه المجموعة من الإجراءات هو توليد مزارع خلايا ثلاثية الأبعاد لتعمل كبدائل لسرطان الثدي في المختبر ، وتقديم طريقة لقياس نمو الخلايا في الأقسام النسيجية للبدائل. تعد زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد طريقة أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية لنمذجة سلوك الخلية في المختبر من زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد. من خلال تغيير التركيب الخلوي في الظروف التجريبية ، يمكن تكييف هذه المجموعة من الإجراءات لمعالجة مجموعة متنوعة من الأسئلة البيولوجية ، ولتقييم فعالية العلاجات المرشحة.

لدمج الخلايا في ECM ، على الجليد ، أضف الخلايا والمكونات الأربعة الأولى ذات الصلة المدرجة في الجدول الأول في المخطوطة المصاحبة ، في أنبوب طرد مركزي دقيق بحجم ملليمترين. بعد ذلك ، امزجها برفق عن طريق سحب العينات ، وتجنب تكوين أي فقاعات. راقب مستوى الأس الهيدروجيني باستخدام الفينول الأحمر في 10XD MEM للتأكد من أن الخليط يظهر لونا برتقاليا ورديا ، مما يشير إلى درجة حموضة سبعة.

إذا ظهر الخليط باللون الأصفر وكان الرقم الهيدروجيني منخفضا جدا ، أضف ببطء 7.5 في المائة من بيكربونات الصوديوم قطرة واحدة في كل مرة حتى يتم الوصول إلى اللون المناسب. تذكر أن تبقي الخليط على الثلج ، وتعمل بسرعة لمنع بلمرة ECM المبكرة. بالنسبة للثقافات الصلبة ثلاثية الأبعاد ، حافظ على شريحة الغرفة على الجليد لمنع بلمرة ECM المبكرة.

قم ببطي 100 لتر ميكرو من خليط ECM للخلية في كل بئر من شريحة غرفة الآبار الثمانية، وقم بماصة خليط ECM الخلوي حول حواف البئر للمساعدة في توزيع الخليط بشكل أفضل. بعد ذلك ، احتضان البدائل عند 37 درجة مئوية ، خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون ، لمدة 45 دقيقة للسماح ببلمرة ECM. بعد خمس وأربعين دقيقة ، أضف 100 ميكرو لتر من وسط الاستزراع إلى كل بئر ، واحتضن عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون طوال مدة التجربة.

قم بتغيير وسيط الثقافة كل يومين. أحد قيود الثقافة ثلاثية الأبعاد هو أن انتشار الأكسجين والمواد المغذية في الحجم قد يكون غير كاف لدعم بقاء الخلية. قد تساعد إضافة نظام مفاعل حيوي في التغلب على هذا القيد وتعزيز النمو.

لإثراء الثقافات ثلاثية الأبعاد في نظام المفاعل الحيوي ، قم بإعداد وتجميع جزء من نظام المفاعل الحيوي الذي يضم البدائل. في غطاء مزرعة الخلية ، باستخدام حقنة بإبرة قياس 26 ، قم بحقن خليط ECM الخلوي في منطقة المفاعل الحيوي للتروية المصمم لاحتواء الخلايا ، وانتقل بسرعة إلى الخطوة التالية. لضمان توزيع أكثر توازنا للخلايا داخل البدائل ، ضع مكون المفاعل الحيوي الذي يضم البدائل في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا.

قم بتدوير البدائل باستمرار عند 18 دورة في الدقيقة أثناء الحضانة عند 37 درجة مئوية في فرن تهجين في الموقع أو حاضنة لمدة 45 دقيقة للسماح ببلمرة ECM. بعد البلمرة وإضافة الوسيط ، قم بتوصيل مجموعة المفاعل الحيوي بالمضخة. ابدأ التروية المتوسطة في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون.

استمر في التروية المتوسطة طوال مدة التجربة ، وقم بتغيير وسط الثقافة كما هو مطلوب للتصميم التجريبي المحدد. في نهاية التجربة ، قم بتغليف البدائل في هلام معالجة العينات للحفاظ على البدائل سليمة أثناء المعالجة ، وتسهيل التقسيم النسيجي. للقيام بذلك ، قم بإذابة جل معالجة العينات في حمام مائي 60 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.

بعد ذلك ، قم بإدخال ما يقرب من 300 لتر ميكرو من هلام معالجة العينات في قاع قالب التبريد المسمى. باستخدام شفرة مشرط وملقط ، قم بإزالة بديل بعناية من المفاعل الحيوي أو من بئر شريحة غرفة مكونة من ثمانية آبار ، وضعها في قوالب التبريد التي تحتوي على هلام معالجة العينات. الماصة حوالي 300 لتر ميكرو من هلام معالجة العينات لتغطية البديل في القالب التبريدي.

ثم احتضنها عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بمجرد أن يصلب جل معالجة العينة ، قم بإزالة هلام معالجة العينات الذي يحتوي على البديل من cryomold وضعه في كاسيت الأنسجة. إذا تم وضع أكثر من بديل واحد في نفس شريط الأنسجة ، فيمكن استخدام أصباغ تعليم الأنسجة لتمييز العينات بعد التثبيت والمعالجة.

بعد ذلك ، ضع كاسيت الأنسجة الذي يحتوي على البديل في تركيبة محايدة بنسبة عشرة بالمائة لمدة عشر إلى اثنتي عشرة ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح بالتثبيت الكامل. بعد التثبيت ، انقل كاسيت الأنسجة الذي يحتوي على البديل إلى 70 بالمائة من الإيثانول. البديل الثابت جاهز الآن للمعالجة إلى البارافين والتقسيم النسيجي اللاحق.

لقياس كثافة الخلايا والصور المجهرية الضوئية للأقسام الملطخة ب H و E ، افتح ملف صورة للبديل. باستخدام أداة Polygon في ImageJ وحواف ECM كدليل، حدد مساحة البديل عن طريق سحب الماوس والنقر لعمل نقاط ربط. بمجرد الخطوط العريضة ، حدد القياس ضمن علامة التبويب تحليل.

بعد ذلك ، قم بتحميل ملفات الصور المستخدمة لقياس المنطقة البديلة في ملف تعريف الخلية عن طريق سحب ملفات الصور إلى قائمة الملفات. بعد ذلك، قم بتعيين اسم لكل صورة تم استيرادها في الوحدة النمطية استيراد الأسماء والأنواع وحدد نوع الصورة. بعد إنشاء مسار التحليل، ابدأ تشغيل وضع الاختبار وانقر فوق تشغيل في محلل ملفات تعريف الخلية.

وقم بتقييم الكائنات التي تمت تصفيتها للتأكد من تحديد غالبية النوى في صورة الاختبار بشكل مناسب ، ويتم اختيار المعلمات المثلى لتحديد الخلايا. سيتم وضع دائرة حول النوى المضمنة باللون الأخضر. ثم احفظ المشروع ، واخرج من وضع الاختبار ، وانقر فوق تحليل الصور.

تظهر هنا صورة تمثيلية للقسم الملون H و E من بديل منفوخ نمت لمدة سبعة أيام. وهذه صورة تمثيلية للقسم الملون ب H و E من بديل صلب ينمو لمدة سبعة أيام مع تغيير متوسط كل يومين. الخلوية أقل بكثير في البدائل الصلبة.

يوضح هذا الرسم البياني مقارنة متوسط عدد الخلايا ذات النواة لكل منطقة بعد سبعة أيام من النمو. بديل مليء بالحيوية والصلبة. تدعم هذه البيانات العددية الخلوية في الرسوم البيانية الدقيقة للصور للأقسام الملطخة H و E.

ويوضح هذا الرسم البياني مقارنة مؤشر وضع العلامات Ki-67 ، وهو مقياس تكاثر الخلايا بعد سبعة أيام من نمو البدائل الصلبة والصلبة. تدعم هذه البيانات مرة أخرى نموا أكبر في البدائل المنفعة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التهجين في الموقع والكيمياء النسيجية الأمينية على الأقسام النسيجية للبدائل للإجابة على أسئلة مثل الحمض النووي الريبي والتعبير عن البروتين.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد ومعالجة بدائل الأنسجة المختبرية ثلاثية الأبعاد ، وإجراء تحليل بديل على الأقسام النسيجية الملطخة ب H و E.