المجهر الإلكتروني من الأنسجة متآكلة إلى تصور مصفوفة خارج الخلية

الهدف العام من هذه الطريقة هو تصور بنية المصفوفة القلبية في حالة عدم وجود خلايا أو مواد أخرى غير مصفوفة. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التليف ، خاصة كيف يمكن أن تؤثر الاختلافات في محتوى المصفوفة على تنظيم المصفوفة ، وكيف يمكن أن تؤثر هذه التغييرات على اعتلال عضلة القلب المختلفة أو الأمراض الليفية الأخرى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر رؤية نوعية للمصفوفة التي يمكن استخدامها لزيادة المقاييس الكمية.

خطرت للدكتور جاليندو والدكتور سوير فكرة استخدام هذه التقنية لأول مرة بعد أن وجدوا أن العلاج المنتظم لخنازير ما بعد الاحتشاء كان له تغيرات في التعبير الجيني تشبه التغيرات في محتوى المصفوفة بعد العلاج. قد يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة إذا لم يكن لديهم خبرة سابقة في إعداد عينة SEM ، بسبب المهارات الحركية الدقيقة المطلوبة. يجب أن تكون عينة الأنسجة كبيرة بما يكفي لرؤيتها بسهولة ، وأن يتم تخزينها في محلول الجلوتارالديهايد بنسبة أربعة بالمائة عند أربع درجات مئوية.

قم بإزالة المناديل من التخزين البارد واشطفها بالماء المقطر. بعد ذلك ، اغمر الأنسجة في محلول يحتوي على 10 في المائة من هيدروكسيد الصوديوم ، المصنوع طازجا من الكريات في الماء. تأكد من اتخاذ الاحتياطات المناسبة.

احتفظ بالأنسجة في محلول هيدروكسيد الصوديوم لمدة ستة إلى 10 أيام في درجة حرارة الغرفة. استمر عندما يصبح لون الأنسجة أبيض فاتح أو أبيض. ثم اشطف المنديل بالماء المقطر حتى يصبح شفافا.

بعد ذلك ، ارتد القفازات واغمر الأنسجة في حمض التانيك بنسبة واحد بالمائة لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة. بعد حمام حمض التانيك ، اشطف المنديل بالماء المقطر طوال الليل. في التحضير ، في غطاء الدخان الذي يرتدي القفازات ، اصنع محلول مخزون 0.2 مولار من محلول كاكوديلات الصوديوم ومحلول مخزون مائي بنسبة اثنين بالمائة من رابع أكسيد الأوزميوم.

استخدم واقي رذاذ الماء ، لأن رابع أكسيد الأوزميوم يمثل خطرا شديدا على الاستنشاق. الآن ، قم بعمل تخفيف 0.1 مولار من المخزن المؤقت كاكوديلات الصوديوم ، واحتضان الأنسجة فيه لمدة خمس دقائق مع تحريك لطيف. قم بتغيير المخزن المؤقت مرتين لغسل الأنسجة ثلاث مرات باستخدام كاكوديلات الصوديوم.

بعد ذلك ، اصنع خليطا واحدا لواحد من مخزون كاكوديلات الصوديوم ورباعي أكسيد الأوزميوم. احتضان الأنسجة في الخليط الجديد على دوار لمدة ساعة. في وقت لاحق ، أعد الأنسجة إلى 0.1 مولار من كاكوديلات الصوديوم واحتضانها بتحريض لطيف لمدة خمس دقائق.

قم بتغيير محلول الاستحمام هذا مرتين خلال 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتجفيف الأنسجة باستخدام سلسلة من حمامات الإيثانول بتركيزات متزايدة. دع الأنسجة تنقع لمدة 15 دقيقة في كل حمام مع تحريك لطيف.

بعد ذلك ، انقل الأنسجة والمحلول إلى طبق بتري ضحل مليء بالإيثانول بنسبة 100 في المائة. بعد ذلك ، بحذر ، أمسك شفرات حلاقة حادة جدا بحيث تكون مسطحات الجوانب على اتصال ببعضها البعض ، وتتقاطع حواف القطع لتشكيل وجهين لمثلث متساوي الأضلاع فوق العينة. الآن ، استخدم يدك المهيمنة لوضع الشفرة الثانية في أقصى يسار العينة ، وقم بتقطيعها إلى اليمين.

وبالتالي ، حرك الشفرات ضد بعضها البعض من اتجاهين متعاكسين لعمل قطع واحد سلس بأقل قدر من التشويه أو قوة التمزق. الهدف هو كشف أكبر مساحة سطح ممكنة دون الإضرار بالعينة. كرر العملية حتى يتم إعداد مقاطع عرضية مرضية كافية للفحص بواسطة SEM.

باستخدام ملعقة أو ملاقط ، انقل الأنسجة إلى حامل عينة CPD ، مع الحفاظ على الأنسجة مغمورة في الإيثانول بنسبة 100 في المائة. لا يمكن تعريض الأنسجة للهواء لأكثر من بضع ثوان. استخدم CPD لاستبدال الإيثانول بثاني أكسيد الكربون السائل ، وقم بإجراء دورة التجفيف كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.

بعد ذلك ، قم بإعداد كعب عينة SEM لكل عينة. قم بلصق علامة لاصقة كربونية على السطح العلوي لكعب الألومنيوم. تحت مجسم ، قم بلصق العينة بعناية بعلامة التبويب اللاصقة بحيث يكون سطح المقطع العرضي محل الاهتمام متجها لأعلى ، بعيدا عن علامة التبويب ، ومستو إلى أقصى حد مع سطح كعب الروتين.

لا تفحص أو تلمس سطح الاهتمام. بالنسبة لأصغر العينات وأكثرها صعوبة ، قم بكسر عصا القضيب الخشبية لاستخدامها كملعقة. أيضا ، اعمل على قطعة كبيرة من ورق الترشيح لتجنب فقدان عينة متساقطة.

لتحسين الالتصاق ، استخدم عصا قضيب مكسورة لعمل فرشاة مدببة ، وقم بتطبيق طلاء فضي أو كربوني على قاعدة وجوانب العينة. قم بتمديد خط رفيع جدا من الطلاء حتى حافة سطح الاهتمام. سيؤدي ذلك إلى إنشاء مسار شحن من سطح الاهتمام إلى الأرض.

بعد ذلك ، قم بتطبيق قطعتين أو ثلاث قطرات صغيرة من الطلاء حول محيط علامة تبويب الكربون لتوفير مسار موصل من سطح علامة التبويب إلى كعب الصلب المعدني. هذا يعمل كأرضية. ضع العينة جانبا واترك الطلاء الموصل يجف لمدة ساعتين.

بمجرد التجفيف ، قم بتشغيل طبقة الرش لتطبيق طبقة ثقيلة نسبيا من سبائك البلاديوم الذهبية أو الذهب على العينة. مطلوب طلاء بسمك 30 إلى 40 نانومتر. قم بإجراء المجهر الإلكتروني الماسح بجهد متسارع منخفض نسبيا لتقليل المشكلات المرتبطة بتبديد الشحنة الضعيف في العينة.

استخدم وضع الضغط المتغير إذا كان متاحا. أولا ، قم بتحسين مسافة العمل لتوفير عمق مجال كاف للتركيز على الألياف في البعد Z. للقيام بذلك ، افتح علامة التبويب التنقل في أعلى اليمين.

ثم قم بالوصول إلى الإحداثيات علامة التبويب من قائمة المرحلة. في ذلك ، أدخل قيمة أكبر لإحداثي Z ، مثل 20 ملم. أخيرا ، اضغط على علامة التبويب Go To لتنفيذ التغيير.

بعد ذلك ، ضع سطح الاهتمام بشكل متعامد مع شعاع الإلكترون. انقر مع الاستمرار فوق زر الماوس الأيمن ، ثم حركه إلى اليسار أو اليمين لتركيز العينة بالقرب من محيط المستوى السطحي المعد محل الاهتمام. لاحظ مسافة العمل المركزة.

بعد ذلك ، باستخدام عصا التحكم في واجهة المستخدم اليدوية ، انقل العرض إلى الحافة المعاكسة وكرر طريقة التركيز. إذا تغيرت مسافة العمل ، فقم بإمالة العينة لتحقيق اتفاق تقريبي في كلا الموقعين. استخدم علامة التبويب الإحداثيات في القائمة المرحلة وأدخل قيمة إمالة في إحداثيات T.

الآن ، قم بتدوير العينة 90 درجة عن طريق إدخال هذه القيمة في حقل إحداثيات R. بعد ذلك ، كرر عملية الإمالة حتى يتم تركيز جميع المواضع على نفس مسافة العمل تقريبا. تم تطبيق التقنية الموصوفة على أنسجة القلب من متبرع بزراعة قلب بشري غير مستخدم.

مصفوفة القلب البشري عبارة عن نسج معقد من البروتينات المتشابكة التي لها نمط يشبه قرص العسل في مقطع عرضي. يبلغ عرض كل هيكل على شكل قرص العسل حوالي 40 ميكرون ، وعادة ما يتحايل على خلية عضلية واحدة. عند توصيلها بواسطة أقراص مقسمة ، يمكن تصور العديد من الخلايا العضلية القلبية كقضيب يمتد بالطول من خلال شكل يشبه النفق.

بالإضافة إلى توفير المعلومات الهيكلية ، يمكن أن يسمح SEM للأنسجة منزوعة الخلايا بإجراء تقييم نوعي ذي مغزى استجابة للإصابة أو الأشكال غير الضارة من اعتلال عضلة القلب ، مثل أنسجة القلب الاحتشية من الخنازير. في دراسة منفصلة ، تبين أن الشكل الإسوي GGF2 ل NRG-1 beta هو علاج علاجي محتمل لقصور القلب. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة جيدة عن كيفية معالجة الأنسجة وأنسجة القلب والمجهر الإلكتروني الماسح ، بما في ذلك تقنية تعريض السطح محل الاهتمام وتركيب العينة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام تقنيات أخرى مثل مواصفات الكتلة وتسلسل الحمض النووي الريبي والعديد من المقايسات الأخرى لقياس بروتينات المصفوفة خارج الخلية وغيرها من المسؤولة عن الإشارات وظواهر المراقبة التنظيمية الأخرى. أيضا ، لا تنس أن رابع أكسيد الأوزميوم مادة كيميائية خطيرة ، نظرا لإمكانية تثبيت الأغشية المخاطية للبخار. تذكر دائما العمل في غطاء الدخان مع قفازات النتريل ، باستخدام واقي من الرذاذ أو وشاح غطاء المحرك.