في المختبر مستعمرة فحوصات للتميز الخلايا السلف ثلاثي قوية المعزولة من الفئران البنكرياس الكبار

الهدف العام من هذه البروتوكولات هو توصيف مستعمرات الخلايا المزروعة من خلايا سلف البنكرياس المعزولة من الفئران البالغة باستخدام فحوصات الثقافات التي تستخدم ميثيل السليلوز المحتوي على وسط شبه صلب. يمكن أن تساعد أساليبنا في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية السلفية للبنكرياس ، مثل ، ما هي قدرات التجديد الذاتي والتمايز للخلايا السلفية في البنكرياس البالغ؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنيات هي أنها تسمح بدراسة الخلايا السلفية الفردية وهو أمر مهم لتمييز إمكاناتها البيولوجية الحقيقية.

خطرت لنا فكرة هذه الطرق لأول مرة عندما أدركنا أن فحوصات المستعمرة كانت تدرس الخلايا الجذعية المكونة للدم يمكن تطبيقها أيضا على مجموعات خلايا البنكرياس. سيظهر الإجراءات جاكوب تريمبلاي ، طالب دراسات عليا ، والدكتورة جانين كويجانو ، ما بعد الدكتوراه ، والآنسة أنجيلا لوه ، فنية ، جميعهم من مختبري. في أقرب وقت ممكن بعد التضحية ، استخدم المقص لعمل شق رأسي على خط الوسط لجدار البطن ، وفتح تجويف البطن.

باستخدام الملقط ، ارفع الطحال برفق ، وقطع النسيج الضام بين الطحال وفص الطحال في البنكرياس بالمقص. قم بقطع الأنسجة الضامة للاثني عشر وفصوص المعدة بنفس الطريقة ، ووضع أنسجة البنكرياس في طبق بتري يحتوي على DPBS مكمل بنسبة 0.1٪ BSA والمضادات الحيوية على الجليد. ثم ، تحت مجهر تشريح ، استخدم ملقطا رفيعا لإزالة الأنسجة الدهنية.

الآن انقل البنكرياس إلى غطاء مزرعة الأنسجة واشطف الأنسجة في ثلاثة أطباق بتري متتالية مقاس 100 ملم تحتوي على 10 مل من PBS البارد بالإضافة إلى BSA لكل منها. بعد الغسيل النهائي ، ضع البنكرياس في طبق بتري جاف معقم لإزالة أكبر قدر ممكن من PBS بالإضافة إلى BSA ، وانقل المناديل إلى طبق بتري جاف آخر على الثلج. بعد ذلك ، استخدم المقص الزنبركي لفرم البنكرياس لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى تتولد قطع رفيعة من الأنسجة ، وقم بتعليق شظايا الأنسجة في ملليلترات إلى ثلاثة ملليلترات من محلول PBS BSA DNase I البارد الطازج.

باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر، انقل القطع إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وأضف ما يكفي من PBS BSA DNase I ليصل الحجم الإجمالي إلى 10 ملليلتر. ثم أضف 350 إلى 450 ميكرولتر من الكولاجيناز B إلى الأنسجة. ضع الأنبوب في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ثماني دقائق ، مع الدوران كل ثلاث إلى أربع دقائق.

في نهاية الحضانة ، استخدم حقنة سعة 10 مليلتر بإبرة قياس 16 ونصف لسحب محلول الأنسجة ورشه لاحقا على جدار الأنبوب سعة 50 مليلتر في درجة حرارة الغرفة سبع مرات. ثم أعد المناديل إلى الحمام المائي لمدة ثماني دقائق أخرى مع الدوران العرضي ، تليها سبع تمريرات عبر المحقنة كما هو موضح للتو. بعد التعطيل الميكانيكي الأخير ، انقل كمية 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى طبق بتري جاف وتأكد من وجود خلايا مفردة ومجموعات خلايا صغيرة الحجم تحت مجهر ضوئي متباين الطور المقلوب مع عدسة موضوعية 10x.

بعد ذلك ، ضع الأنبوب على الجليد وارفع الحجم الإجمالي إلى 50 مليلتر باستخدام PBS BSA DNase I.الطرد المركزي للخلايا ، واستخدم ماصة P1000 لإعادة تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من PBS BSA DNase I البارد ، ثم قم بتصفية الخلايا من خلال مرشح شبكي من النايلون 70 ميكرون متبوعا بمرشح شبكة نايلون 40 ميكرون في أنبوب مخروطي جديد من مادة البولي بروبيلين سعة 50 مل. اضبط مستوى الصوت على 5 ملليلتر من PBS BSA DNase I ، واحسب الخلايا. ثم قم بتخفيف معلق الخلية المفردة إلى تركيز نهائي مرتين في 10 إلى الخلايا السبع لكل مليلتر في PBS BSA DNase I البارد على الجليد.

لتركيب مستعمرات البنكرياس المناعية بالكامل المزروعة في ميثيل السليلوز الذي يحتوي على وسط شبه صلب ، قم أولا بإعداد ماصة باستور زجاجية بفتحة دقيقة باستخدام موقد بنسن. بعد ذلك ، قم بتوصيل الطرف الصغير لطرف ماصة سعة مليلتر واحد بأحد طرفي أنبوب مطاطي رفيع الجدران وقطعة لسان حال بالطرف الآخر. قم بتوصيل ماصة باستور الزجاجية بالطرف الكبير لطرف الماصة.

ثم اسحب 10 إلى 50 ميكرولترا من وسط DMEM / F12 مع واحد بالمائة من ميثيل السليلوز في ماصة الفم. الآن ضع طبق المستعمرات على مرحلة مجهر تباين الطور المقلوب واستخدم هدف 10x للعثور على مستعمرات مناسبة للقطف. ثم ضع فتحة الماصة بجوار المستعمرة ذات الأهمية ، وقم بتطبيق الشفط ببطء على الفم لاختيار مستعمرة واحدة.

للحصول على مجموعة فعالة، من المهم التأكد من أن المستعمرة ذات الأهمية في بؤرة التركيز قبل وضع فتحة الماصة الزجاجية بجوار مجموعة الخلايا. بمجرد حصاد المستعمرة ، ضع طرف الماصة في بئر واحد من صفيحة بئر 96 تحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد وقم بإيداع المستعمرة في البئر. بعد جمع جميع المستعمرات ، قم بإصلاح المستعمرات طوال الليل عند أربع درجات مئوية مع الاهتزاز برفق.

في صباح اليوم التالي ، اغسل المستعمرات مرتين في PBS لمدة 10 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. من هذه النقطة فصاعدا ، التقط المستعمرات باستخدام ماصة بلاستيكية P10 ذات طرف منحني. بعد الغسيل الثاني ، قم بتخزين المستعمرات الثابتة طوال الليل في أنابيب سعة 1.5 مليلتر مملوءة بالبارافين عند أربع درجات مئوية.

ثم انقل المستعمرات إلى آبار فردية من صفيحة سوداء 96 بئر مع قاع شفاف يحتوي على 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل بئر. احتضن الطبق طوال الليل عند أربع درجات مئوية مع رج لطيف. في صباح اليوم التالي ، انقل المستعمرات إلى آبار جديدة تحتوي على 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي محل الاهتمام لثقافة ليلية أخرى عند أربع درجات مئوية مع اهتزاز لطيف.

في صباح اليوم التالي ، انقل المستعمرات إلى ثلاثة آبار متتالية تحتوي على 200 ميكرولتر من PBS بالإضافة إلى 0.1٪ Tween 20 لمدة 10 دقائق من الغسيل في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل الثالث ، انقل المستعمرات إلى آبار نظيفة تحتوي على 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المناسب ، واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين في الظلام. في نهاية الحضانة ، اغسل المستعمرات ثلاث مرات في PBS Tween كما هو موضح للتو ، وانقل المستعمرات إلى آبار جديدة من DAPI لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بتجميع المستعمرات الملطخة بالمناعة في طبق بتري ذو قاع زجاجي مقاس 35 ملم وقم بتغطيتها بقلة غطاء. أخيرا ، قم بتصوير المستعمرات على مجهر متحد البؤر. يمكن إثراء الخلايا السلفية للبنكرياس البالغة عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلور باستخدام معلمات البوابات المناسبة ، حيث توجد قدرة تكوين المستعمرة فقط داخل الخلايا الأقنية الإيجابية CD133 Sox9 / EGFP.

يمكن بعد ذلك تصنيف مستعمرات البنكرياس وفقا لشكلها عن طريق الفحص المجهري الضوئي المتباين للطور المقلوب. بعد الانتقاء اليدوي ، يمكن أيضا تحليل المستعمرات عن طريق تحليل qRT-PCR للموائع الدقيقة للتعبير الجيني ، أو عن طريق التلوين المناعي الكامل للتعبير عن البروتين. في الواقع ، تعبر العديد من المستعمرات الفردية عن علامات النسب لخلايا القناة والغدد الصماء والخلايا الأسينار ، على سبيل المثال ، مما يشير إلى أن غالبية مستعمرة البنكرياس الناشئة التي تشكل أسلاف لهذه المستعمرات ثلاثية القوة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال إجراءات التشريح والتفكك وتلوين الخلايا وفرزها وطلاء الخلايا في إجراءات وسط ميثيل السليلوز التي تحتوي على ميثيل السليلوز في غضون ست إلى سبع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد تكوين المستعمرة ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل RT-PCR الكمي أو اللطخة الغربية أو فحوصات إفراز الأنسولين للإجابة على أسئلة إضافية حول التعبير الجيني أو القدرات الوظيفية للمستعمرات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فصل بنكرياس الفئران البالغ وكيفية توصيف المستعمرات المتولدة لخلايا سلف البنكرياس في ميثيل السليلوز التي تحتوي على ثقافات شبه صلبة.