جيل من خلايا الفأر مجرى الهواء طلائي المشتقة ESC عن طريق Decellularized الرئة السقالات

الهدف العام من هذا الإجراء هو توجيه تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للفئران إلى خلايا ظهارية ناضجة للمجاري التنفسية، باستخدام نظام استنبات ثلاثي الأبعاد (3D) مع سكاكر رئوية منزوعة الخلايا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال تطور الرئة، مثل دور انكماشات المصفوفة الخلوية وإشارات عامل النمو أثناء تمايز سلالة الرئة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في استخدام نظام استنبات ثلاثي الأبعاد في بيئة محددة خالية من المصل، وتحقيق تمايز ظهاري قوي للمجاري التنفسية مع تلوث محدود من سلالات الأديم الباطن الأخرى. بعد القتل الرحيم لجرذ Wistar بالغ، وفقاً للبروتوكول المكتوب، يتم تثبيت الحيوان على سطح التشريح عن طريق تثبيت القوائم الأمامية والخلفية، واستخدام 70% ethanol لرش الصدر والبطن. يتم إجراء شق أسفل القفص الصدري مباشرة. ويتم القطع عبر الجلد وكشف الحجاب الحاجز. بعد ذلك، يتم إجراء شقوق صغيرة في الحجاب الحاجز للتسبب في تراجع الرئتين، مما يقلل من فرص ثقبهما. بعد ذلك، يتم إجراء شق رأسي على طول عظمة القص، وفتح التجويف الصدري للوصول إلى القلب والرئتين. ثم باستخدام خيط جراحي، يتم ربط الوريد الأجوف السفلي، واستخدام مقص تشريح صغير لإحداث شق صغير في الأذين الأيسر. باستخدام حقنة 10ml مُجهزة بإبرة مقاس 25 gauge مملوءة بمحلول Hank's Balance salt المضاف إليه heparin، يبدأ تروية الرئة عن طريق إدخال الإبرة في البطين الأيمن، ودفع المحلول المنظم عبر الدورة الدموية الرئوية. تستمر التروية حتى تتحول الرئتان إلى اللون الأبيض، ويصبح السائل المتدفق من الأذين الأيسر صافياً. بعد التروية، يتم كشف الرغامي، وإجراء شق صغير بالقرب من الغضروف الدرقي لإدخال القنية. بعد ذلك، باستخدام قسطرة بلاستيكية، يتم تقنيّة الرغامي واستخدام خيط جراحي لتثبيتها في مكانها. الآن، يتم إعداد نظام تروية بالجاذبية عن طريق تثبيت حقنة 10ml على حامل ثلاثي ومشبك. ثم يتم إزالة مكبس الحقنة والتخلص منه. يتم تثبيت نقطة التعبئة القصوى على أسطوانة الحقنة على ارتفاع 20 cm فوق الرئتين، ثم يتم توصيل صمام إيقاف ثنائي الاتجاه بنهاية الحقنة، وأنبوب بلاستيكي طويل بالطرف الآخر من الصمام. يتم سحب القسطرة برفق من الرغامي وتوصيلها بنهاية الأنبوب البلاستيكي. ثم يُصب محلول نزع الخلايا في الحقنة ويُترك المحلول ليملأ الأنبوب البلاستيكي والقسطرة الموصولة تماماً. توضع القسطرة المملوءة بالمحلول مرة أخرى في الرغامي ويتم غسل الرئتين عن طريق الملء حتى السعة الرئوية الكلية لمدة دقيقة واحدة. ثم تُزال القسطرة من الرغامي للسماح للسائل بالتدفق خارج الرئتين. تكرر عملية غسل الرئتين ثماني مرات بمحلول نزع الخلايا، تليها عشر عمليات شطف باستخدام PBS. ستظهر الرئتان باللون الأبيض عند اكتمال خطوات الغسل. بعد ذلك، يتم تشريح الرغامي والرئتين من الرقبة والتجويف الصدري. يتم إزالة الأنسجة الزائدة من الرئتين المشرحتين، بما في ذلك المريء والقلب، ثم تُنقل الرئتان إلى PBS بارد حتى التحضير للتقطيع بجهاز vibratome. لتحضير مقاطع سميكة، يتم تحضير حوالي 15ml من agarose منخفض درجة الانصهار بتركيز 2% و 4% في PBS، وكمية كافية من agarose بتركيز 6% لتضمين جميع الفصوص في كتل مستطيلة صغيرة. بعد نقل agarose إلى أنابيب 15ml، توضع الأنابيب على كتلة تسخين ويتم الحفاظ على درجة الحرارة فوق 40 degrees celsius لتجنب الهلامية. باستخدام مقص صغير، يتم تشريح الرئة منزوعة الخلايا عند نهاية كل شعبة فصية وفصل كل فص. ثم تُستخدم أوراق ماصة لإزالة PBS الزائد، وتُنقل الفصوص إلى agarose بتركيز 2% على كتلة التسخين لمدة خمس دقائق لطلاء النسيج. بعد نقل كل فص إلى طبق بتري، يوضع الطبق على لوحة تبريد ويُترك السطح ليتحول إلى هلام لمدة دقيقة واحدة. توضع الفصوص برفق في agarose بتركيز 4%، وبعد التحضين لمدة خمس دقائق والتبريد، تكرر عملية الطلاء باستخدام agarose بتركيز 6%. بعد الطلاء، تُستخدم قوالب ذات قاعدة معدنية لتضمين كل فص على حدة في agarose بتركيز 6%، مع وجود 3ml على الأقل من agarose تحيط بالنسيج من الحواف. بعد ذلك، وباستخدام ملقط، يتم توجيه كل فص عن طريق وضع أكبر حافة مسطحة للنسيج على سطح القالب المعدني مواجهة للباحث، ويتم إكمال التضمين باستخدام كاسيتات بلاستيكية. تُترك الكتل لتتحول إلى هلام على لوحة تبريد لمدة 30 minutes على الأقل قبل التقطيع بجهاز vibratome. بدلاً من ذلك، تُخزن الكتل في غرفة رطبة لمدة تصل إلى 12 hours في درجة حرارة four degrees celsius قبل التقطيع بجهاز vibratome. لتحضير المقاطع، يتم إعداد جهاز vibratome عن طريق ملء غرفة التقطيع بـ PBS بارد. يتم إعداد حمام ثلجي محيط للحفاظ على درجة حرارة باردة طوال عملية التقطيع. الآن، تُزال الكتل من القوالب المعدنية، ويُستخدم شفرة حلاقة لتقليم agarose الزائد المحيط بالفصوص، مع الإبقاء على حوالي three millimetres من حافة النسيج. باستخدام مادة لاصقة، يتم تثبيت النسيج في مركز لوحة العينة، وتغمر اللوحة في غرفة التقطيع المملوءة بـ PBS. يتم تحميل شفرة التقطيع على جهاز vibratome. تُضبط حدود التقطيع على جهاز vibratome باختيار قيم السرعة والسعة والسمك التالية على التوالي. يتم تقطيع كل فص بالكامل، وإذا لم تنفصل المقاطع تماماً عن بعضها البعض، يُستخدم مقص صغير لقص المقاطع يدوياً. ثم تُجمع مقاطع السكاكر برفق وتُنقل إلى PBS بارد. باستخدام ملقط، يتم تحرير كل مقطع برفق من agarose المحيط به. لتطهير مقاطع السكاكر، بعد نقلها من PBS إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة، يتم إضافة 90 units per milliliter من nuclease في PBS، والتحضين على جهاز دوار في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 إلى 24 hours. بعد نقل المقاطع إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة، ووفقاً للبروتوكول المكتوب، يتم إضافة محلول مضاد للميكروبات تحت ظروف معقمة، والتحضين على جهاز دوار في درجة حرارة الغرفة لمدة six hours. ثم تحت ظروف معقمة، يُستخدم PBS لشطف السكاكر مرتين ونقلها إلى وسط خالٍ من المصل، أو SFDM، قبل الاستزراع بالخلايا. لإعداد استنبات الواجهة بين الهواء والسائل، تُستخدم ملاقط معقمة لوضع أغشية كارهة للماء على طبق بتري. ثم يُنقل كل مقطع سكاكر منزوع الخلايا من SFDM إلى غشاء، مع التأكد من توزيع المقاطع بالتساوي على الغشاء. يتم تحضير أطباق ذات ست أو اثنتي عشرة فجوة عن طريق ملء الفجوات بـ 1ml أو 0.5ml من SFDM على التوالي. ثم توضع الأغشية برفق في الفجوات، مما يسمح للغشاء بالطفو فوق الوسط لإنشاء نظام استنبات الواجهة بين الهواء والسائل. لاستزراع السكاكر ثلاثية الأبعاد، وبعد تحضير خلايا الأديم الباطن وفرز الخلايا المنشط بالفلورة لزيادة تركيز الأديم الباطن النهائي، يُستخدم haemocytometer لعد الخلايا المفروزة. ثم يتم تدوير الخلايا عند 400 Gs لمدة five minutes. باستخدام SFDM، يتم إعادة تعليق الخلايا المترسبة إلى حوالي 100,000 cells في 10