جيل من خلايا الفأر مجرى الهواء طلائي المشتقة ESC عن طريق Decellularized الرئة السقالات

الهدف العام من هذا الإجراء هو توجيه تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر إلى خلايا ظهارية مجرى الهواء الناضجة ، باستخدام ثقافة ثلاثية الأبعاد تم إعدادها باستخدام سقالات رئة منزوعة الخلايا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال نمو الرئة ، مثل دور تقلصات مصفوفة الخلايا وإشارات عامل النمو أثناء تمايز سلالة الرئة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد في بيئة محددة خالية من المصل ، وتحقق تمايزا قويا في مجرى الهواء مع تلوث محدود من سلالات الأديم الباطن الأخرى. بعد القتل الرحيم لفأر ويستار البالغ ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بتأمين على سطح تشريح عن طريق تثبيت الكفوف الأمامية والساقين الخلفية ، واستخدم 70٪ من الإيثانول لرش الصدر والبطن. قم بإنشاء شق أسفل القفص الصدري مباشرة. قطع الجلد وكشف الحجاب الحاجز. بعد ذلك ، قم بعمل شقوق صغيرة عبر الحجاب الحاجز ، للتسبب في تراجع الرئتين ، مما يقلل من فرصة ثقب الرئتين. بعد ذلك ، قم بإنشاء شق عمودي على طول القص ، وافتح التجويف الصدري للوصول إلى القلب والرئتين. ثم باستخدام خياطة ، اربط الوريد الأجوف السفلي ، واستخدم مقصا صغيرا لوضع شق صغير في الأذين الأيسر. باستخدام حقنة محضرة سعة 10 مل بإبرة قياس 25 مملوءة بمحلول ملح Hank's Balance الهيباريني ، ابدأ نضح الرئة عن طريق إدخال الإبرة في البطين الأيمن ، وادفع المخزن المؤقت عبر الدورة الدموية الرئوية. استمر في التروية حتى تتحول الرئتان إلى اللون الأبيض ، ويصبح السائل المتدفق من الأذين الأيسر صافيا. بعد التروية ، قم بكشف القصبة الهوائية ، وقم بعمل شق صغير بالقرب من غضروف الغدة الدرقية للقناء. ثم ، باستخدام قسطرة بلاستيكية ، قم بإزالة القصبة الهوائية واستخدام خياطة لتثبيتها في مكانها. الآن ، قم بإعداد نظام نضح الجاذبية عن طريق تثبيت حقنة 10 مل على حامل معوجة ومشبك. ثم قم بإزالة مكبس المحقنة والتخلص منه. قم بتأمين أقصى نقطة تعبئة على برميل المحقنة على ارتفاع 20 سم فوق الرئتين ، ثم قم بتوصيل محبس ثنائي الاتجاه بنهاية المحقنة ، وأنبوب بلاستيكي طويل بالطرف الآخر من المحبسة. اسحب القسطرة برفق من القصبة الهوائية ، وقم بتوصيلها بنهاية الأنبوب البلاستيكي. بعد ذلك ، صب محلول إزالة الخلايا في المحقنة واترك المحلول يملأ الأنابيب البلاستيكية والقسطرة المرفقة بالكامل. ضع القسطرة المملوءة بالمحلول مرة أخرى في القصبة الهوائية واغسل الرئتين عن طريق ملء سعة الرئة الإجمالية لمدة دقيقة واحدة. ثم قم بإزالة القسطرة من القصبة الهوائية للسماح للسائل بالتدفق خارج الرئتين. كرر غسل الرئتين ثماني مرات بمحلول إزالة الخلايا ، متبوعا بعشر شطف باستخدام PBS. ستظهر الرئتان باللون الأبيض مع الانتهاء من خطوات الغسيل. ثم قم بتشريح القصبة الهوائية والرئتين من تجويف الرقبة والصدر. قم بإزالة الأنسجة الزائدة من الرئتين المقطوعة ، بما في ذلك المريء والقلب ، ثم انقل الرئتين إلى PBS البارد حتى التحضير لتقطيع الاهتزاز. لتحضير أقسام سميكة ، اصنع ما يقرب من 15 مل من 2٪ و 4٪ من نقطة الانصهار المنخفضة في PBS ، وما يكفي من 6٪ agarose لتضمين جميع الفصوص في كتل مستطيلة صغيرة. بعد نقل الاغاروز إلى أنابيب سعة 15 مل ، ضع الأنابيب على كتلة حرارية وحافظ على درجة الحرارة أعلى من 40 درجة مئوية لتجنب التبلور. باستخدام مقص صغير ، قم بتشريح الرئة منزوعة الخلايا في نهاية كل قصبات هوائية فصيصية ، وافصل كل فص. ثم استخدم صفائح ماصة لإزالة PBS الزائد ، وانقل الفصوص إلى 2٪ agarose على كتلة التسخين لمدة خمس دقائق لتغطية الأنسجة. بعد نقل كل فص إلى طبق بتري ، ضع الطبق على طبق بارد واترك السطح يتجل لمدة دقيقة واحدة. ضع الفصوص برفق في 4٪ agarose ، وبعد الحضانة لمدة خمس دقائق والتبريد ، كرر الطلاء بنسبة 6٪ agarose. بعد الطلاء ، استخدم قوالب القاعدة المعدنية لتضمين كل فص على حدة في 6٪ agarose ، مع ما لا يقل عن 3 مل من الاغاروز يحيط بالأنسجة من الحواف. بعد ذلك ، باستخدام الملقط ، قم بتوجيه كل فص عن طريق وضع أكبر حافة مسطحة للأنسجة على سطح القالب المعدني المواجه للمجرب ، وأكمل التضمين باستخدام أشرطة بلاستيكية. اترك الكتل توضع على طبق بارد لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل تقطيع الاهتزاز. بدلا من ذلك ، قم بتخزين الكتل في غرفة رطبة لمدة تصل إلى 12 ساعة عند أربع درجات مئوية قبل تقسيم الاهتزاز. لتحضير الأقسام ، قم بإعداد الاهتزاز عن طريق ملء غرفة التقسيم ب PBS البارد. قم بإعداد حمام جليدي محيط للحفاظ على درجة حرارة باردة طوال فترة التقسيم. الآن ، قم بإزالة الكتل من القوالب المعدنية ، واستخدم شفرة حلاقة لتقليم الاغاروز الزائد المحيط بالفصوص ، مع الحفاظ على ما يقرب من ثلاثة ملليمترات من حافة الأنسجة. باستخدام مادة لاصقة ، قم بتثبيت الأنسجة في وسط لوحة العينة ، واغمر اللوحة في غرفة التقسيم المملوءة ب PBS. قم بتحميل شفرة التقسيم على الاهتزاز. قم بتعيين حدود التقسيم على الاهتزاز ، عن طريق تحديد قيم السرعة والسعة والسمك التالية على التوالي. قسم كل فص تماما ، وإذا لم تنفصل الأقسام تماما عن بعضها البعض ، فاستخدم مقصا صغيرا لقص الأقسام يدويا. بعد ذلك ، اجمع أقسام السقالة برفق ، وانقلها إلى PBS بارد. باستخدام الملقط ، حرر كل قسم برفق من الاغاروز المحيط. لتطهير أقسام السقالات ، بعد نقلها من PBS إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، أضف 90 وحدة لكل مليلتر من النوكلياز في PBS ، واحتضن على دوار في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 إلى 24 ساعة. بعد نقل الأقسام إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الجديدة ، وفقا لبروتوكول النص ، في ظل ظروف معقمة ، أضف محلول مضاد للميكروبات ، واحتضان على دوار في درجة حرارة الغرفة لمدة ست ساعات. ثم في ظل ظروف معقمة ، استخدم PBS لشطف السقالات مرتين ونقلها إلى وسط خال من المصل ، أو SFDM ، قبل البذر بالخلايا. لإعداد ثقافة واجهة سائل الهواء ، استخدم ملقطا معقما لوضع أغشية كارهة للماء على طبق بتري. بعد ذلك ، انقل كل قسم سقالة منزوعة الخلايا من SFDM إلى غشاء ، مع ضمان انتشار الأقسام بالتساوي على الغشاء. قم بإعداد ستة أو اثني عشر لوحا جيدا عن طريق ملء الآبار ب 1 مل أو 0.5 مل من SFDM على التوالي. بعد ذلك ، ضع الأغشية برفق في الآبار ، مما يسمح للغشاء بالطفو فوق الوسط مما يخلق مزرعة سائل هواء. لزرع السقالات ثلاثية الأبعاد ، بعد تحضير خلايا الأديم الباطن وفرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، لإثراء الأديم الباطن النهائي ، استخدم مقياس الدم لحساب الخلايا التي تم فرزها. ثم قم بتدوير الخلايا عند 400 جي لمدة خمس دقائق. باستخدام SFDM ، أعد تعليق الخلايا المحببة إلى ما يقرب من 100،000 خلية في 10