تسجيلات خلية كاملة التصحيح، المشبك في الدماغ شرائح

الهدف العام من هذا الإجراء هو وصف كيفية إجراء تسجيلات مشبك التصحيح للخلية بأكملها في شرائح الدماغ التي تم تشريحها حديثا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل كيفية تغيير التلاعب التجريبي بالتحكم في نشاط خلايا عصبية معينة في مناطق معينة من الدماغ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر وسيطا لتحديد التغيرات طويلة الأمد لإعداد X vivo في وظائف الخلايا العصبية التي تطورت في المستيقظة السليمة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للوظائف العصبية في شرائح الدماغ ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى ، مثل الخلايا في الثقافة والخلايا العصبية في الجسم الحي. سيوضح الإجراء فرانسيسكو جارسيا أوسكوس ، طالب من مختبري. لبدء هذا الإجراء ، باستخدام ماصة نقل بلاستيكية ذات رأس مشذب ، اسحب شريحة دماغ واحدة برفق من غرفة الاسترداد.

ضع ماصة النقل في غرفة التسجيل، واضغط برفق على الشريحة من الماصة على بطانة انزلاق الغطاء في الجزء السفلي من الغرفة. بعد ذلك ، باستخدام هدف المجهر 4x ، ضع الشريحة بحيث يتم وضع المنطقة المطلوبة تماما في وسط غرفة التسجيل. بعد تحقيق الموضع المطلوب ، قم بتأمين موضع شريحة الدماغ مع الضغط على الشريحة ، والمعروفة أيضا باسم القيثارة.

بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى هدف 40x ، وقم بخفض العدسة برفق حتى تلامس ACSF في الغرفة. بعد ذلك ، استخدم عجلة الضبط الدقيقة لتركيز الأنسجة. عندما يكون التركيز على مستوى الأنسجة ، راقب الخلايا في المنطقة المستهدفة.

الآن ، ابحث عن خلية مستهدفة. ضع علامة عليها على شاشة الكمبيوتر للمساعدة في توجيه الماصة الدقيقة التسجيل. ارفع العدسة الشيئية للسماح بمساحة كافية لوضع الماصة الدقيقة للتسجيل.

في هذه الخطوة باستخدام حقنة سعة مليلتر واحد ، وإبرة حقنة غير معدنية ، ومرشح مخصص ، املأ ماصة دقيقة بالمحلول الداخلي المعد مسبقا. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في الماصة الدقيقة. ثم ضع الماصة الدقيقة في حامل قطب كهربائي ، بحيث يتلامس المحلول مع قطب السلك المطلي بكلوريد الفضة.

شد غطاء الماصة، بحيث تشكل الغسالة المخروطية ختما حول الماصة الدقيقة. بعد ذلك، قم بالضغط الإيجابي باستخدام المحقنة المملوءة بالهواء المتصلة بحامل الماصة قبل غمر الماصة الدقيقة في ACSF لمنع الحطام من دخولها. باستخدام المعالج الدقيق، قم بتوجيه الماصة لأسفل إلى الغرفة بحيث تكون تحت مركز الهدف المغمور تقريبا.

أثناء تحريك الماصة الدقيقة باستخدام الملاعب الدقيقة بسرعة متوسطة إلى عالية، حدد موقع الماصة الدقيقة على شاشة الكمبيوتر، وقم بتوجيه الماصة الدقيقة نحو موقع الخلية على المحور XY. في غضون ذلك ، قم بقياس مقاومة الماصة الدقيقة عن طريق تطبيق خطوة الجهد. استخدم ضغطا إيجابيا لإزالة أي فقاعات هواء أو أجسام غريبة أخرى تسد الماصة الدقيقة.

بعد مسح الماصة الدقيقة ، قم بإجراء إزاحة الجهد لتقليل تيار الماصة إلى الصفر. باستخدام عجلة التركيز البؤري الدقيقة للمجهر، ابدأ التركيز البؤري لأسفل مع خفض الماصة الدقيقة تدريجيا. قم دائما بالتركيز لأسفل أولا ثم اخفض الماصة الدقيقة إلى مستوى التركيز البؤري للتأكد من أن طرف الماصة الدقيقة لا يخترق الشريحة فجأة.

عندما تتلامس الماصة الدقيقة مع سطح الشريحة، قم بإبطاء سرعة المعالج الدقيق إلى الوضع المنخفض المتوسط. اضغط برفق على الضغط الإيجابي الخفيف لإزالة أي حطام على المسار. ثم اقترب من الخلية ، إما بالتناوب مع مقابض التحكم XYZ أو عن طريق الاقتراب قطريا حيث يتم تغيير كلا المحورين XZ مع دوران مقبض المحور Z.

عندما تكون الماصة الدقيقة قريبة بدرجة كافية من الخلية ، ستظهر غمازة على سطح الخلية. الآن قم بتطبيق شفط ضعيف وقصير من خلال الأنبوب المتصل بأنبوب شفط حامل الماصة من أجل إنشاء مانع للتغلب. أثناء تشكيل ختم جيجا ، استخدم قائد مكبر الصوت الذي يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر لإحضار الخلايا التي تحمل إمكانات الراحة الفسيولوجية من أجل منع التغيرات المفاجئة ، بمجرد تمزق الغشاء.

بعد تشكيل ختم الجيجا ، عوض عن المكابسات السريعة أو البطيئة. هنا من المهم جدا ألا يكون الشفط المطبق قويا جدا. خلاف ذلك ، قد يتمزق الغشاء قبل إنشاء الختم.

إذا ظل الختم مستقرا وأعلى من جيجا واحد ، فقم بتطبيق شفط قصير وقوي لتمزيق غشاء البلازما. يجب أن يكون الشفط قصيرا وأقوى من الضغط المطبق عند وضع الختم. من أجل تمزيق الغشاء بشكل صحيح ، وتحقيق تكوين مستقر للخلية الكاملة.

التبديل إلى وضع الخلية في اختبار الغشاء ، اعرض المعلمات المختلفة للخلية ، مثل مقاومة الإدخال ، ومقاومة السلسلة ، والمكثفات الغشائية. بعد تحقيق تكوين الخلية بأكملها ، استمر في مراقبة هذه المعلمات أثناء التسجيل. يظهر هنا ، مثال على منحدر EPSCs المستحث من نواة واحدة متكئة قذيفة MSN.

زيادة درجة الحرارة من 24 إلى 28 وإلى 32 درجة مئوية ، يزيد من ميل EPSCs المستحثة. هنا يتم تقييم سعة EPSCs المستحثة في وضع مشبك الجهد عند 80 مللي فولت تحت الصفر. عندما تزداد مقاومة السلسلة ، ينخفض اتساع EPSCS المستحث.

وهنا ، مثال على الآثار من خليتين عصبيتين توضح تأثير مقاومة المدخلات على قدرة الخلايا العصبية على توليد الارتفاعات. يتم تثبيت الخلايا العصبية الحالية وتثبيتها عند 80 مللي فولت تحت الصفر. عندما تزداد مقاومة المدخلات ، يزداد عدد إمكانات الفعل أيضا.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن توليد شرائح دماغية صحية أمر بالغ الأهمية. من المهم أيضا مراقبة المعلمات التي قد تؤثر على شكل موجة الإشارة الكهربائية ، مثل مقاومة السلسلة ومقاومة الإدخال ودرجة الحرارة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد للجانب الأساسي لتقنية تسجيل الخلية الكاملة في شرائح الدماغ.