ال
مايو 18, 2016
هنا، يتم وصف بروتوكول لموسم الحصاد وصيانة وعلاج الماوس organoids الأمعاء الصغيرة مع الممرض المرتبطة أنماط الجزيئية (PAMPs) والمستوحدة الليستيريا، وكذلك التركيز على التعبير الجيني وتقنيات التطبيع المناسبة للبروتين.
الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس تأثيرات التحدي الممرض على عضوانيات الأمعاء الدقيقة، مع التركيز على تقنيات التسوية مقابل العدد الإجمالي للخلايا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات المناعة الفطرية والمخاطية من خلال توفير وسيلة لاستقصاء تفاعلات المضيف والممرض للبكتيريا مع الخلايا الظهارية المعوية في المختبر. ومن الضروري في هذا الإجراء استخدام طريقة التسوية مقابل العدد الإجمالي للخلايا، وهو أمر ضروري عند قياس البروتينات التي تفرزها العضوانيات عبر تقنيات مثل ELISA. لحصاد خبايا الأمعاء الدقيقة للفئران من أجل زراعة العضوانيات، ابدأ باستخدام شريحة زجاجية معقمة لكشط الزغابات بلطف من السطح اللمعي للأمعاء الدقيقة. بعد ذلك، استخدم مقص تشريح لقطع الأنسجة إلى شرائط بطول 1-2 سنتيمتر. وضع الشرائط في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter يحتوي على 10 milliliters من PBS بارد جداً. اخلط المحتويات عن طريق القلب اللطيف واترك محتويات الأنسجة تترسب في قاع الأنبوب. ثم، اشفط PBS واغسل الشرائط ثلاث مرات إضافية في 10 milliliters من PBS طازج، في كل مرة بنفس الطريقة. في نهاية الغسلة الأخيرة، ضع الأنبوب على الجليد لمدة عشر دقائق. بعد ذلك، استبدل PBS بـ 25 milliliters من PBS مدعم بـ 2 millimolar EDTA، في دلو ثلج على منصة هزازة لمدة 45 دقيقة. في نهاية الحضانة، اترك شرائط الأنسجة تترسب في قاع الأنبوب واستبدل PBS-EDTA بـ 10 milliliters من PBS مدعم بـ 10%FBS. رج الأنبوب بقوة يدوياً عشر مرات. ثم، اترك الأنسجة تترسب في قاع الأنبوب وانقل الطافي إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter موصوم بـ "الكسر 1". قم برج الأنسجة في PBS FBS خمس مرات إضافية، مع نقل الطافي إلى أنبوب كسر جديد في كل مرة. بعد الرج الأخير، قم بطرد مركزي لجميع العينات وأعد تعليق الرواسب في خمسة milliliters من DMEM/F12 المسخن مسبقاً بدون عوامل نمو مضافة. الآن، قم بتدوير العينات مرة أخرى واشفط أربعة milliliters من الطافي من كل أنبوب. أعد تعليق الرواسب في المليلتر الأخير المتبقي من الوسط واستخدم حصصاً مقدارها 20 microliter من كل كسر لمعاينة الخبايا والحطام على شرائح زجاجية. بعد تجميع الكسور المناسبة لتحقيق أعلى نسبة من الخبايا إلى الحطام، قم بطرد مركزي للكسور المجمعة واشفط كل الطافي باستثناء آخر 50-100 microliters. مع إبقاء الأنابيب على الجليد، أضف 1 milliliter من مصفوفة البروتين إلى الكسور المجمعة، مع السحب والدفع بالماصة ببطء لمنع إضافة فقاعات الهواء. ثم، أضف 50 microliters من معلق مصفوفة البروتين/الخبايا في منتصف كل بئر من 37
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة بروتوكولاً لحصاد العضويات المعوية الصغيرة للفئران والحفاظ عليها ومعالجتها باستخدام الأنماط الجزيئية المرتبطة بالممرضات (PAMPs) وبكتيريا Listeria monocytogenes. كما تركز المقالة على التعبير الجيني وتقنيات التنميط الصحيحة لتحليل البروتين.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء الدقيقة
- بيولوجيا الخلية
خلفية علمية
- تعتبر العضوانيات المعوية الصغيرة للفأر ذات قيمة عالية في دراسة بيولوجيا الأمعاء.
- تلعب الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs) دوراً في الاستجابات المناعية.
- يعد فهم التعبير الجيني أمراً بالغ الأهمية لتفسير النتائج التجريبية.
- تعتبر تقنيات المعايرة ضرورية لإجراء تحليل دقيق للبروتينات.
الغرض من الدراسة
- توفير بروتوكول مفصل للعمل مع العضوانيات المعوية الصغيرة للفئران.
- استكشاف تأثيرات PAMPs وبكتيريا Listeria monocytogenes على هذه العضوانيات.
- تسليط الضوء على أهمية تحليل التعبير الجيني والمعايرة.
الطرق المستخدمة
- حصاد عضوانيات الأمعاء الدقيقة للفئران.
- الحفاظ على مستنبتات العضوانيات تحت ظروف محددة.
- معالجة العضوانيات بالأنماط الجزيئية المرتبطة بالممرضات (PAMPs) وبكتيريا Listeria monocytogenes.
- تحليل التعبير الجيني وتقنيات تقييس البروتين.
النتائج الرئيسية
- تم تحقيق الصيانة والمعالجة الناجحة للعضوانيات.
- لوحظت تغيرات في التعبير الجيني بعد المعالجة.
- أدت تقنيات التسوية إلى تحسين دقة تحليل البروتين.
- يمكن تطبيق هذا البروتوكول في دراسات متنوعة تشمل بيولوجيا الأمعاء.
الاستنتاجات
- يعد البروتوكول الموصوف فعالاً لدراسة العضويات المعوية.
- تؤثر الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs) وبكتيريا Listeria monocytogenes بشكل كبير على التعبير الجيني.
- تعتبر تقنيات التسوية المناسبة بالغة الأهمية للحصول على نتائج موثوقة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
توفر العضوانيات المعوية للفئران المستخرجة خارج الجسم (Ex vivo mouse intestinal organoids) نظاماً ذا صلة فسيولوجية لاستقصاء التفاعلات بين المضيف والممرض وإشارات المناعة الفطرية في الأنسجة المخاطية. ويعالج تركيز البروتوكول على المعايرة مقابل العدد الإجمالي للخلايا تحدياً حرجاً في توليد بيانات كمية قابلة للتكرار من مستنبتات العضوانيات غير المتجانسة. وتدعم هذه القدرة الثقة التنبؤية في مراحل الاكتشاف المبكر والتحقق من الأهداف للبرامج العلاجية التي تركز على المناعة والميكروبيوم.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يُمكِّن من الاستقصاء الميكانيكي لمسارات مستقبلات التعرف على الأنماط في سياقات الخلايا الطلائية الأولية.
- يدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال نمذجة التفاعلات المعقدة بين المضيف والممرض خارج الجسم الحي (ex vivo).
- يسهل التحقق الوظيفي من الأهداف الخاصة بمعدِّلات المناعة الفطرية.
- يعزز الثقة التنبؤية في تطوير أصول علم المناعة.
الفحص وتطوير المقايسة
- يجهز أنظمة عضوانيات مُصادق عليها لعمليات الفحص اللاحقة للمركبات المعدلة للمناعة.
- يعالج مسألة توحيد المقايسات وقابلية تكرارها من خلال تقنيات معايرة صارمة.
- يتيح القياس الكمي للبروتينات المفرزة، مما يدعم التقييم الموثوق للمركبات.
- يدعم إمكانية توسيع المنصة وإعادة استخدامها عبر برامج الاكتشاف المختلفة.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- يتماشى مع البيولوجيا المخاطية ذات الصلة بالأمراض لاستكشاف المؤشرات الحيوية الانتقالية.
- يوفر الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري في دراسات المناعة ووظيفة الحاجز.
- يقلل من مخاطر قرارات التطوير من خلال نمذجة الاستجابات الظهارية ذات الصلة فسيولوجياً.
تكامل مسار العمل والتدفق التشغيلي
يتكامل هذا البروتوكول ضمن سلسلة عمليات الاكتشاف، بدءاً من اختبار الفرضيات الأولية وصولاً إلى تحديد المركبات الواعدة والتحقق قبل السريري لبرامج المناعة المخاطية وتفاعلات المضيف والميكروبات.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بمسارات إشارات المناعة الفطرية وآليات التفاعل بين المضيف والممرض.
- الفحص المنهجي: يوفر قراءات كمية وقابلة للتكرار لتحليل البروتينات المفرزة في مقاييس العضيّات.
- التحليلات: يتيح إجراء المعايرة بناءً على إجمالي عدد الخلايا، مما يحسن إمكانية المقارنة بين الظروف التجريبية المختلفة.
- الأبحاث الترجمية: يربط النتائج المخبرية (in vitro) بالبيولوجيا المخاطية داخل الكائن الحي (in vivo) لتحقيق مواءمة المؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس لسير عمل قائم على العضيّات وقابل لإعادة الاستخدام في محافظ البحث والتطوير الخاصة بالمناعة والميكروبيوم.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من صحة الأهداف.
- القيمة التشغيلية: توحد معايير التطبيع والتقدير الكمي في أنظمة العضوانيات المعقدة.
- القيمة الاستراتيجية: تتيح اتخاذ قرارات مدروسة بشأن المضي قدماً أو التوقف، وتدفع عجلة تطوير المحفظة بكفاءة رأسمالية.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر لأصول علم المناعة والميكروبيوم.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة العضوانيات وبيولوجيا الخلايا الظهارية.
- يتطلب الوصول إلى أجهزة متخصصة في زراعة الأنسجة وقياس كمية البروتين.
- يستلزم توحيد معايير بروتوكولات التسوية والتحليل بين الفرق المختلفة.
- قد يتطلب التعديل ليتناسب مع أنواع مختلفة من العضوانيات أو نماذج الأمراض.
- يمكن أن يؤثر التباين في نمو العضوانيات وتكوين المصفوفة على إمكانية تكرار المقايسة.
