ال فيفو السابقين الثقافة والتعرف على الأنماط مستقبلات تحفيز ماوس المعوية Organoids

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس آثار التحدي الممرض على عضيات الأمعاء الدقيقة مع التركيز على تقنيات التطبيع مقابل العدد الكلي للخلايا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجالات المناعية الفطرية والمخاطية من خلال توفير وسيلة للتحقيق في تفاعلات مسببات الأمراض المضيفة للبكتيريا مع الخلايا الظهارية المعوية في المختبر. من الضروري لهذا الإجراء طريقة التطبيع مقابل العدد الكلي للخلية ، وهي ضرورة عند قياس البروتينات المفرزة العضوية عبر تقنيات مثل ELISA.To حصاد الخبايا المعوية الدقيقة للفأر للثقافة العضوية ، ابدأ باستخدام شريحة زجاجية معقمة لكشط الزغابات برفق من السطح اللمعي للأمعاء الدقيقة. بعد ذلك ، استخدم مقص تشريح لتقطيع الأنسجة إلى شرائح بطول 1-2 سم. وضع الشرائط في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من PBS المثلج. امزج المحتويات عن طريق الانعكاس اللطيف واترك محتويات الأنسجة تستقر في قاع الأنبوب. بعد ذلك ، قم بشفط PBS وغسل الشرائط ثلاث مرات أخرى في 10 مل من PBS الطازج ، في كل مرة بنفس الطريقة. في نهاية الغسيل النهائي ، ضع الأنبوب على الثلج لمدة عشر دقائق. بعد ذلك ، استبدل PBS ب 25 مل من PBS مكملة ب 2 مللي مولار EDTA ، في دلو ثلج على منصة هزازة لمدة 45 دقيقة. في نهاية الحضانة ، اسمح لشرائط الأنسجة بالاستقرار في قاع الأنبوب واستبدل PBS-EDTA ب 10 ملليلتر من PBS مكمل بنسبة 10٪ FBS. هز الأنبوب بقوة باليد عشر مرات. بعد ذلك ، اسمح للأنسجة بالاستقرار في قاع الأنبوب ونقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يسمى ، الكسر 1. نقل المادة الطافية إلى أنبوب كسر جديد في كل مرة. بعد التحريض الأخير ، قم بالطرد المركزي لجميع العينات وأعد تعليق الكريات في خمسة ملليلتر من DMEM / F12 الدافئ مسبقا بدون عوامل نمو إضافية. الآن ، قم بتدوير العينات مرة أخرى واستنشق أربعة ملليلتر من المادة الطافية من كل أنبوب. أعد تعليق الكريات في آخر مليلتر من الوسط المتبقي واستخدم 20 ميكرولتر من كل جزء لتصور الخبايا والحطام على الشرائح الزجاجية. بعد تجميع الكسور المناسبة لتحقيق أكبر نسبة مئوية من نسبة القبو إلى الحطام ، قم بالطرد المركزي للكسور المجمعة واستنشق جميع المواد الطاففية باستثناء آخر 50-100 ميكرولتر. مع إبقاء الأنابيب على الجليد ، أضف 1 مليلتر من مصفوفة البروتين إلى الكسور المجمعة ، مع سحب العينات لأعلى ولأسفل ببطء لمنع إضافة فقاعات الهواء. ثم أضف 50 ميكرولترا من مصفوفة البروتين / تعليق القبو في منتصف كل بئر من 37