العزلة ومن التنميط Exosomes من الصفراء الإنسان التي تحتوي على الرنا الميكروي

الهدف العام من هذه الطريقة هو عزل الإكسوسومات من الصفراء البشرية لمزيد من التحليلات بما في ذلك توصيف الحمض النووي الريبي الدقيق. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض الكبد مثل الكشف عن علامة صفراوية معينة لسرطان القنوات الصفراوية أو أمراض القنوات الصفراوية الأخرى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قوية وقابلة للتكرار.

لإجراء تصوير البنكرياس والقنوات الصفراوية بالمنظار ، أو ERCP ، ابدأ بوضع المريض في وضع ضعيف. بعد التنبيب وتمرير منظار الاثني عشر عبر فم المريض ، أدخله في الجزء الثاني من الاثني عشر وحدد الحليمة الرئيسية. قم بتقشير القناة الصفراوية المشتركة بشكل انتقائي عن طريق إدخال العضلة العاصرة ثلاثية التجويف المحملة مسبقا بسلك توجيه محب للماء مقاس 0.35 بوصة أو 0.9 ملم.

تحت التوجيه بالتشريب الفلوري ، قم بدفع السلك التوجيهي إلى القناة الكبدية اليسرى ثم تقدم العضلة العاصرة خمسة سنتيمترات إلى القناة الصفراوية للحصول على وضع مستقر. بعد إزالة السلك التوجيهي ، قم بتوصيل حقنة 10 ملم بمنفذ سلك التوجيه من خلال القفل السفلي واستخدم 10 ملليلتر من الضغط السلبي لشفط الصفراء. قم بإزالة المحقنة التي تحتوي على الصفراء وبعد إعادة إدخال السلك التوجيهي ، قم بحقن عامل التباين من خلال منفذ الحقن لتعتيم الشجرة الصفراوية.

بعد ذلك ، انقل الصفراء المجمعة إلى أنبوب سعة 15 مليلتر على الجليد ، وإذا تم تخزينها لفترة لاحقة ، فقم بالطرد المركزي للعينة عند 500 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق قبل التجميد عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. للمضي قدما على الفور في عزل الإكسوسوم ، قم بنقل 400 ميكرولتر من الصفراء إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وجهاز طرد مركزي عند 300 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق لجمع الخلايا وحطام الخلايا. لمزيد من التنظيف ، انقل المحلول إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الطازجة وقم بالطرد المركزي للعينات عند 16 ، 500 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.

ثم في خزانة السلامة الحيوية ، اجمع المادة الطافية في حقنة وقم بتصفيتها من خلال مرشح غشاء بولي إيثر سلفون 0.2 ميكرومتر لإزالة أي جزيئات متبقية أكبر من 200 نانومتر. انقل المادة الطافية المفلترة إلى أنابيب الطرد المركزي الفائق واستخدم PBS لرفع الأنابيب إلى ثلثيها على الأقل ممتلئة لمنع الأنابيب من الانهيار أثناء الطرد المركزي. بيليه الإكسوسومات من خلال الطرد المركزي الفائق عند 120 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 70 دقيقة.

ستحتوي الحبيبات الصفراء الصغيرة على الإكسوسوم. تخلص من المادة الطافية عن طريق صب النفايات بعناية وتطهيرها عن طريق إضافة المبيض إلى التركيز النهائي بنسبة 10٪ الحجم لكل حجم. ثم اتركه لمدة 20 دقيقة.

بالنسبة للتجارب النهائية ، إما معالجة الكريات بحجم صغير من المحلول المناسب أو إعادة تعليقها في 50 إلى 100 ميكرولتر من PBS وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامها في المستقبل. بعد إعداد شبكات من الحويصلات خارج الخلية الملطخة بالتباين ، أو EVs ، وفقا لبروتوكول النص ، احصل على صور باستخدام مجهر إلكتروني باستخدام جهد تسارع يبلغ 80 كيلو فولت بدءا من تكبير 20 ، 000 X ، ويزيد إلى 100 ، 000 X ، عند تحديد حجم الجسيمات. الإكسوسومات صغيرة جدا بحيث لا يمكن اكتشافها عن طريق الفحص المجهري العادي أو قياس التدفق الخلوي. ومع ذلك ، يوضح هذا الشكل نتائج تحليل تتبع الجسيمات النانوية النموذجي ، أو NTA ، للإكسوسومات التي تقيس توزيع التركيز والحجم ، والتي بلغ متوسطها 97 نانومترا في عينة الصفراء البشرية المعزولة.

يمكن أيضا استخدام المجهر الإلكتروني لتأكيد حجم الجسيمات المعزولة في الصفراء البشرية ويوضح هذا الشكل نتيجة EM نموذجية للإرسال. تم فحص هذه البقع الغربية بحثا عن البروتينات المخصبة في الإكسوسومات مثل tetraspanin CD63 و Tsg101. تظهر مخطط التضخيم في الوقت الفعلي مجموعة متنوعة من أنواع الحمض النووي الريبي الصغير المستخرجة من الإكسوسومات الصفراوية البشرية.

نظرا لأن الإكسوسومات تفتقر إلى معايير موثوقة مثل الحمض النووي الريبي الريبوزومي 18S أو 28S أو جينات التدبير المنزلي ، فإن ارتفاع الحمض النووي الريبي الميكرو الاصطناعي مهم للتطبيع. يمكن إجراء تقنية عزل Exos في غضون ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على الصفراء ومعالجتها من المرضى أو لعزل وتحليل الحويصلات خارج الخلية.

أثناء التراجع عن هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الطرد المركزي للعينة عند 500 جم وأربع درجات قبل التجميد عند 80 تحت الصفر ، إذا لم تتمكن من متابعة الطرد المركزي الفائق. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل دراسات الحمض النووي الريبي الصغير من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ملفات تعريف الحمض النووي الريبي الصغير. لا تنس أن العمل مع الصفراء يمكن أن يكون خطيرا للغاية لأنه قد يحتوي على التهاب الكبد ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ونظارات السلامة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للبحث في مجال أبحاث سرطان القنوات الصفراوية لاستكشاف الحويصلات خارج الخلية كمؤشر حيوي محتمل في الصفراء من المرضى الذين يعانون من مشاكل في القنوات الصفراوية مثل انسداد PSA.