العزلة ومن التنميط Exosomes من الصفراء الإنسان التي تحتوي على الرنا الميكروي

الهدف العام من هذه الطريقة هو عزل الإكسوسومات من الصفراء البشرية لإجراء المزيد من التحليلات، بما في ذلك تحديد ملامح microRNA. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال أمراض الكبد، مثل الكشف عن علامة صفراوية محددة لسرطانات القنوات الصفراوية أو أمراض القنوات الصفراوية الأخرى. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها قوية وقابلة للتكرار.

لإجراء تصوير البنكرياس والقنوات الصفراوية بالتنظير الرجعي، أو ERCP، ابدأ بوضع المريض في وضعية الاستلقاء الظهري. بعد إدخال المنظار الاثني عشري وتمريره عبر فم المريض، أدخله في الجزء الثاني من الاثني عشر وحدد الحليمة الكبرى. قم بتsبيب القناة الصفراوية الشائعة بشكل انتقائي عن طريق إدخال قاطع للعضلة العاصرة ثلاثي التجاويف محمل مسبقاً بسلك توجيه محب للماء بقطر 0.35-inch أو 0.9-millimeter.

تحت توجيه التنظير التألقي، قم بدفع السلك الدليل إلى القناة الكبدية اليسرى، ثم ادفع قاطع المصرة مسافة خمسة سنتيمترات داخل القناة الصفراوية لتحقيق وضعية ثابتة. بعد إزالة السلك الدليل، قم بتوصيل سرنجة سعة 10-milliliter بمنفذ السلك الدليل عبر القفل السفلي، واستخدم ضغطاً سالباً بقوة 10 milliliters لشفط الصفراء. قم بإزالة السرنجة التي تحتوي على الصفراء، وبعد إعادة إدخال السلك الدليل، احقن المادة الظليلة عبر منفذ الحقن لتعتيم الشجرة الصفراوية.

بعد ذلك، انقل العصارة الصفراوية المجمعة إلى أنبوب سعة 15 milliliter على الثلج، وفي حال التخزين لوقت لاحق، قم بطرد العينة مركزياً عند 500 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق قبل التجميد عند درجة حرارة -80 °C. وللمباشرة فوراً في عزل الإكسوسومات، انقل 400 µL من العصارة الصفراوية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وقم بالطرد المركزي عند 300 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق لتجميع الخلايا وبقايا الخلايا. ولمزيد من تنقية السائل الطافي، انقل المحلول إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة وقم بطرد العينات مركزياً عند 16,500 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك، وفي كابينة السلامة البيولوجية، اجمع السائل الطافي في سرنجة وقم بترشيحه عبر مرشح غشائي من البولي إيثر سلفون بمسامية 0.2-micrometer لإزالة أي جزيئات متبقية يزيد حجمها عن 200 nanometers. انقل السائل الطافي المرشح إلى أنابيب طرد مركزي فائق، واستخدم PBS لملء الأنابيب إلى ثلثي سعتها على الأقل لمنع انهيار الأنابيب أثناء عملية الطرد المركزي. قم بترسيب الإكسوزومات عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 120,000 ×g ودرجة حرارة أربع درجات Celsius لمدة 70 minutes.

ستحتوي كريّة صفراء صغيرة على الإكسوسومات. تخلص من السائل الطافي عن طريق السكب بعناية، ثم قم بتطهير النفايات بإضافة المبيّض حتى يصل التركيز النهائي إلى 10% حجماً بالنسبة للحجم. بعد ذلك، اتركها لمدة 20 دقيقة.

بالنسبة للتجارب اللاحقة، إما أن تتم معالجة الراسبات في حجم صغير من المحلول المناسب أو إعادة تعليقها في 50 إلى 100 µL من PBS وتخزينها عند درجة حرارة -80 °C للاستخدام المستقبلي. بعد تحضير شبكات الحويصلات خارج الخلوية، أو EVs، المصبوغة بالصبغة التباينية وفقاً للبروتوكول المكتوب، يتم التقاط الصور باستخدام مجهر إلكتروني بجهد تسريع قدره 80 kV، بدءاً من تكبيرات 20,000 X، وزيادتها حتى 100,000 X عند تحديد حجم الجسيمات. تعتبر الإكسوسومات صغيرة جداً بحيث لا يمكن اكتشافها بواسطة المجهر العادي أو قياس التدفق الخلوي؛ ومع ذلك، يوضح هذا الشكل نتائج تحليل تتبع الجسيمات النانوية النموذجي، أو NTA، للإكسوسومات والتي تقيس التركيز وتوزيع الحجم، والذي بلغ متوسطه 97 nm في عينة الصفراء البشرية المعزولة هذه.

يمكن أيضاً استخدام المجهر الإلكتروني للتأكد من حجم الجسيمات المعزولة في الصفراء البشرية، ويظهر هذا الشكل نتيجة نموذجية للمجهر الإلكتروني النافذ. تم فحص لطخات ويسترن هذه للكشف عن البروتينات المتركزة في الإكسوزومات مثل التيتراسبانين CD63 وTsg101. يوضح مخطط التضخيم في الوقت الفعلي هذا مجموعة متنوعة من أنواع microRNA المستخلصة من إكسوزومات الصفراء البشرية.

بما أن الإكسوسومات تفتقر إلى معايير موثوقة مثل RNA الريبوزومي 18S أو 28S أو الجينات المرجعية، فإن إضافة microRNA اصطناعي يعد أمراً هاماً لعملية التسوية. يمكن إتمام تقنية عزل الإكسوسومات في غضون ثلاث ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على الصفراء من المرضى أو الحيوانات ومعالجتها لعزل الحويصلات خارج الخلية وتحليلها.

أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر طرد العينة مركزياً عند 500 G ودرجة حرارة أربع درجات قبل التجميد عند -80، وذلك في حال عدم القدرة على إجراء الطرد المركزي الفائق. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل دراسات microRNA للإجابة على أسئلة إضافية مثل ملفات microRNA. ولا تنسَ أن العمل مع الصفراء قد يكون خطيراً للغاية نظراً لاحتمالية احتوائه على التهاب الكبد، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء القفازات ونظارات السلامة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

بعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للأبحاث في مجال سرطان القنوات الصفراوية لاستكشاف الحويصلات خارج الخلوية كعلامات حيوية محتملة في الصفراء لدى المرضى الذين يعانون من مشاكل في القنوات الصفراوية، مثل انسداد PSA.