حقن خلايا الفئران مسانج الميلانوما لتحديد ما إمكاناتهم الإنتقالية في الرئتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار طريقة لإنتاج الأورام النقيلية في ستة فئران سوداء. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال العلاج المناعي مثل كيفية تأثير العوامل الاستقصائية على الاستجابة المناعية في الرئتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها نقائل تجريبية.

لذا فإن النتائج موثوقة ومتسقة نسبيا. للبدء ، ضع مزارع خلايا الورم الميلانيني B16-BL6 ، والتي يجب أن تكون عند التقاء 70٪ تقريبا ، في غطاء معقم. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من 05٪ تريبسين EDTA إلى كل طبق واترك الخلايا لمدة دقيقة واحدة.

بعد شفط هذا المحلول ، استمر في إضافة مليلتر واحد من التربسين إلى كل طبق ، ثم أعد الخلايا إلى الحاضنة. بعد 10 دقائق ، انقل الخلايا إلى غطاء معقم وأضف أربعة ملليلتر من وسط RPMI الخالي من المصل إلى كل لوحة. ثم اجمع الخلايا بماصة آلية معقمة.

لتفتيت الكتل التي يمكن أن تسد إبرة الطرد، اضغط على طرف الماصة على قاع اللوحة وطرد الخلايا. بعد تكرار هذه العملية عدة مرات ، تذكر الخلايا وانقلها إلى أنبوب مخروطي 15 ملليتر. ثم قم بإزالة عينة من تعليق الخلية ، وأدخلها في مقياس الدم ، وحدد كثافة الخلية.

قم بتخصيص تعليق الخلية بالتساوي في أربعة أنابيب سعة 15 مل. ثم الطرد المركزي الأنابيب ، وبعد ذلك صب المادة الطافية. تابع تسمية كل أنبوب بكثافة خلية مختلفة -0 أو 0.063 أو 0.125 أو 0.25 أو 0.5 مليون خلية لكل مليلتر.

ثم أضف حجما مناسبا من RPMI الخالي من المصل إلى كل مخروطي لإنتاج هذه التركيزات النهائية. تأكد من كثافة الخلايا المطلوبة باستخدام مقياس كثافة الدم. بعد ذلك ، خصص 500 ميكرولتر من كل تعليق في أنابيب 1.8 ملليلتر موضوعة على الجليد.

بعد إعداد جميع معلقات الخلايا B16-BL6 ، حدد الماوس. أمسكها من الذيل ، وقم بتوجيه الخلفي أولا إلى مقيد. عندما يكون جذع الفأر في الغرفة الرئيسية وذيله خارج الجهاز ، استمر في سحب باتجاه نهاية التقييد.

بعد ذلك ، أدخل المكبس التقييدي واستمر في الضغط على المكبس حتى يصبح الماوس آمنا. بمجرد وضع في مكانه ، قم بتدوير الماوس 90 درجة بحيث يكون أحد عروق الذيل الجانبية متجها لأعلى. ثم استخدم وسادة كحول لتنظيف جانب ذيل الماوس بقوة حيث يكون الوريد أكثر وضوحا.

للتحضير للحقن ، قم أولا بجمع 300 ميكرولتر من 0.5 مليون خلية لكل مليلتر معلق في حقنة. بعد ذلك ، قم بإخراج الفقاعات من المحقنة عن طريق قلبها ، ونفض الغبار على جانبها ، ودفع المكبس. بمجرد إزالة الفقاعات ، أخرج مزرعة الخلية لإنتاج حجم نهائي يبلغ 250 ميكرولتر في المحقنة.

تابع تمديد ذيل الماوس باليد غير المهيمنة. امسكها بحيث ترفع السبابة الطرف القريب من الذيل ويضغط الإبهام على الجزء البعيد. باستخدام اليد المهيمنة ، أدخل الإبرة في الوريد باتجاه الطرف البعيد من الذيل بزاوية دقيقة لأسفل.

ثم أدخل الإبرة أكثر ، واضبطها بحيث تتطابق مع زاوية الوريد الذيل. بعد إدخال الإبرة حوالي سنتيمتر واحد في وريد الذيل ، ابدأ في دفع المكبس مع تثبيت المحقنة. أوقف أي نزيف عن طريق تثبيت الشاش على موقع الدخول.

بمجرد إخراج معلق الخلية ، قم بإزالة الإبرة من الوريد وتخلص منها. بعد ذلك ، قم بإزالة المكبس من التقييد وضع الماوس في قفص المستلم. يهدف هذا البروتوكول إلى تحديد العدد الأمثل لخلايا B16-BL6 المراد حقنها لإنشاء نموذج مفيد للورم الميلانيني النقيلي.

تظهر هنا بؤر تجريبية يشار إليها بالسهام المتكونة في الرئتين بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من حقن خمس كثافات مختلفة للخلايا. عندما تم حقن 500 ، 000 خلية لكل مليلتر ، غطت البؤر الرئتين بالكامل. في المثال الموضح هنا ، تم حساب 102 بؤرة.

في المقابل ، تم تغطية الرئتين بشكل ضئيل فقط في البؤر عندما تم حقن 62،500 خلية لكل مليلتر أو 125،000 خلية لكل مليلتر. على التوالي ، أدت هذه الكثافات إلى عدد بؤر الرئة واحد و 17. باستخدام هذه الطريقة, تقرر أن التركيز الأمثل للخلايا للحقن كان 250, 000 خلايا في المليلتر.

أدت هذه الكثافة إلى رئتين بحوالي 65 بؤرة ، وهو رقم لم تكن فيه الأعضاء مغطاة بالكامل ولا يتم تغطيتها بشكل ضئيل بالبؤر. يوضح التعداد الإضافي لهذه البيانات عند رسمها بيانيا وجود علاقة خطية تقريبا بين بؤر الرئة وكثافة زراعة الخلايا فوق 125،000 خلية لكل مليلتر كما هو موضح هنا. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في أقل من ساعة ، يعتمد عدد الفئران ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة الإجراء ، من المهم أن تتذكر محاولة حقن عدد مكافئ من الخلايا لكل فأر. بعد هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى ، مثل توصيل الدواء ، للإجابة على أسئلة مثل كيفية تأثير العلاجات المحتملة على عدد من البؤر الناتجة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق لباحثي السرطان لاستكشاف مكونات السرطان النقيلي في الورم الميلانيني في ستة فئران سوداء.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية جمع خلايا B16-BL6 وإعدادها ، وكبح جماح الفئران ، وإعداد الإبر ، وحقن عدد مكافئ من الخلايا في كل وريد ذيل. لا تنس أن العمل مع ثقافة الثدييات والإبر يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل تجنب عصي الإبر وارتداء معدات الحماية.