التعبير وتنقية جزيئات تشبه الفيروسات للتطعيم

هنا، نقدم بروتوكول لتجميع جزيئات تشبه الفيروس باستخدام الفيروسة العصوية أو الأنظمة التعبير الثدييات، وتنقية تنبيذ فائق. يستخدم هذا النهج عالية للتخصيص لتحديد المضادات الفيروسية كأهداف لقاح بطريقة آمنة ومرنة.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تنقية الجسيمات الشبيهة بالفيروسات ، أو VLPs ، التي يتم التعبير عنها وإفرازها بواسطة أنظمة التعبير عن الثدييات أو خلايا الحشرات. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال اللقاح ، مثل كيفية التعبير عن المستضدات الفيروسية ذات الصلة بالتوافق وتنقيتها بطريقة آمنة ومرنة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب ترسيب البروتين باستخدام البولي إيثيلين جلايكول أو تحضير طبقات متعددة الكثافة لتركيز VLPs.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتحديد المستضدات الفيروسية كأهداف للقاحات ، إلا أنه يمكن أيضا استخدام VLPs كأدوات لتشخيص الأمراض وعلم الأمصال. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم طبقة الجلسرين الأساسية في خطوات إعادة تعليق VLP لأن المبتدئين قد يفشلون في ممارسة التقنية المناسبة. في يوم الحمل ، قم بإعداد محاليل الجسيمات الدهنية والحمض النووي وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.

قم بنقل خلايا الحمض النووي بتكوين الحمض النووي من واحد إلى واحد إلى اثنين من HA إلى NA إلى Gag وكمية إجمالية من الحمض النووي تبلغ 40 ميكروغراما لكل قارورة T150. كرر هذه الخطوة لإنشاء تسعة قوارير T150 ، بحجم إجمالي يبلغ 200 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بتخفيف محاليل الحمض النووي والشحميات في وسائط نقل خالية من المصل بدون مضادات حيوية ، بحيث تحتوي كل قارورة على حجم إجمالي يبلغ 24 ملليلترا.

أعد القوارير إلى الحاضنة وحافظ على الخلايا ووسط ثقافة النقل حتى يوم حصاد جسيم يشبه الفيروس ، أو VLP. انقل المادة الطافية إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر لحصاد المزرعة من الخلايا بعد 72 إلى 96 ساعة من النقل. قم بتدوير الخلايا لأسفل لتكسير الحطام الخلوي.

اجمع المواد الطافية وقم بتصفيتها من خلال غشاء صب 0.22 ميكرون. تم تحضير الثقافة مسبقا spodoptera frugiperda ، أو خلايا Sf9 ، في التعليق في قوارير دوارة ، عن طريق التقليب المستمر عند 130 دورة في الدقيقة على نظام لوحة النمام متعدد النقاط. حافظ على أحجام المزرعة بما لا يزيد عن نصف حجم قارورة الدوار للتهوية المناسبة.

بعد ذلك ، عبر عن CHIK VLPs عن طريق إصابة 250 مل من خلايا Sf9 في قارورة دوارة بكثافة اثنين في عشرة إلى الخلايا الست لكل مليلتر مع فيروس باكوتشي مؤتلف معد مسبقا ، وإعادة الخلايا إلى حاضنة 28 درجة مئوية. استخدم استبعاد التريبان الأزرق لتحديد ما إذا كانت صلاحية الخلية قد انخفضت إلى 70 إلى 80٪ عند التأكيد ، انقل الثقافات مباشرة من التعليق إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر وقم بتدوير الخلايا لأسفل. اجمع المواد الطافية وقم بتصفيتها من خلال غشاء صب 0.22 ميكرون قبل الترسيب.

تعقيم ستة أنابيب طرد مركزي فائقة مقاس 25 ملم × 89 ملم مع 70٪ من الإيثانول. ثم تأكد من جفاف الإيثانول تماما. قم بتحميل 32 مل من المواد الطفية في الأنابيب النظيفة.

بعد ذلك ، قم بوضع أساس بعناية للطاقات بثلاثة ملليلتر من الجلسرين المعقم بنسبة 20٪ و PBS. ضع الجلسرين تحت الجلسرين ببطء لتجنب تعطيل طبقة الكثافة الرقيقة بين الجلسرين ومحلول VLP. سيؤدي توزيع الجلسرين بسرعة كبيرة إلى اختلاط محاليل الجلسرين و VLP ، مما يقلل من ترسيب VLP.

تأكد من توازن الأنابيب ، ثم ابدأ الدوران. بعد أربع ساعات ، قم بإزالة الأنابيب من جهاز الطرد المركزي. استنشق المادة الطافية ، مع الحرص على عدم إخراج الحبيبات من الأنبوب.

أعد تعليق VLPs المترسب في 100 ميكرولتر على الأقل في الجزء السفلي من الأنابيب باستخدام PBS معقم عن طريق سحب العينة برفق وببطء لأعلى ولأسفل. يجب إجراء إعادة تعليق حبيبات VLP بشفط متكرر لطيف وبطيء وطرد PBS باستخدام ماصة. تجنب تكوين الفقاعات للحد من خسارة VLP.

أخيرا ، قم بتخزين VLPs المعلقة. تم الحصول على أحجام VLP وإجمالي إنتاجية البروتين من مقايسة BCA التقليدية من مجموعة متنوعة من تركيبات SVP و VLP. تتراوح إنتاجية CHIK SVP من خلايا Sf9 بين 0.008 إلى 0.016 ملليغرام من إجمالي البروتين لكل مليلتر من حجم المادة الطافية.

بينما ينتج عن الإنتاج من خلال الثدييات 293 خلية تائية انخفاضا في البروتين بمقدار عشرة أضعاف. تظهر صورة الرسم المجهري الإلكتروني هذه أن VLPs الأساسية للإنفلونزا HA Gag يتم التعبير عنها وتجميعها وتنقيتها بنجاح على أنها VLPs. حسنا ، عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر نقل وإصابة مزارع الخلايا السليمة والقابلة للحياة فقط لأن هذا سيؤثر على مستويات التعبير الكلي عن البروتين.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات BCA و ELIZA و HA من أجل قياس محتوى البروتين الكلي ومحتوى المستضد المحدد والتعبير عن HA الوظيفي. لا تنس أن العمل باستخدام جهاز طرد مركزي فائق يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل موازنة الأنابيب ، واستخدام الدوارات والسرعات الموصى بها فقط ، والإشراف المناسب على موظفي المختبر الجدد أثناء تنفيذ هذا الإجراء.