Name: التعبير وتنقية جزيئات تشبه الفيروسات للتطعيم (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: تعلم تنقية جزيئات تشبه الفيروسات (VLPs) المُعبّرة في الخلايا الثديية أو الحشرية باستخدام الطرد المركزي الفائق. تُسهّل هذه الطريقة تحديد المستضدات الفيروسية كأهداف للقاحات بأمان ومرونة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونود أن ننوه أعضاء مسبق من مختبر روس الذين ساهموا في تحسين بروتوكول للكفاءة القصوى والعوائد.

1. نظام التعبير الثدييات لتوليد الأنفلونزا H3N2 فلب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subclone الفيروسي الهيكلي بروتين هيماغلوتينين (HA)، النورامينيداز (NA)، وفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) الكمامة P55 في ناقلات التعبير حقيقية النواة، مثل pTR600 سبق وصفها 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم الحمض النووي في القولونية المختصة كيميائيا (على سبيل المثال، DH5α) وعزل ترنسفكأيشن الصف البلازميد باستخدام طقم تنقية البلازميد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. كمية من الحمض النووي يعتمد على المحصول واحتياجات المستخدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على خط خلية الثدييات، 293T، في وسائل الإعلام نمو تحتوي على 10٪ مصل الجنين-البقري (FBS) عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا مثل أن T-150 زراعة الأنسجة قارورة تحتوي على 45-75 × 10 6 خلايا في قارورة بحيث قارورة يحصل الالتزام خلية كاملة و85-95٪ confluency خلية في اليوم التالي. تفقد الخلايا تحت المجهر لconflu المطلوبency. ملاحظة: عادة ما ينصح ارتفاع كثافة الخلية لانتاج بروتين تعبير الأمثل مع الحد الأدنى من السمية الخلوية عند استخدام الكواشف ترنسفكأيشن التجارية ولكن الإفراط في confluency قد يؤدي إلى تراكم النفايات الخلوية من المنتجات والحد من بقاء الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم ترنسفكأيشن، وإعداد الحويصلية وخليط الحمض النووي حسب توصيات الشركة الصانعة وtransfect خلايا الحمض النووي مع تركيبة الحمض النووي من 1: 1: 2 من HA: NA: الكمامة بلغ إجمالي كمية الحمض النووي من 40 ميكروغرام لكل T-150 قارورة. تمييع حلول الحمض النووي والحويصلية في وسائل الإعلام ترنسفكأيشن المصل خالية دون المضادات الحيوية مثل أن كل قارورة تحتوي على إجمالي حجم 20-30 مل. ملاحظة: نسبة يبني الجين قد تتطلب التحسين المستخدم. على الرغم من أن لم تظهر هنا، وقد تم تنفيذ إجراء ترنسفكأيشن مماثلة مع الجهاز التنفسي المخلوي فيروس (RSV) F وفيروس نقص المناعة البشرية الكمامة في نسبة 1: 1. لDENV وCHIKV البلازميدات تعبير واحد، أي ما مجموعه 20 ميكروغرام من الحمض النووي في T-150 قارورة تستخدم له الأمثلxpression. الحمض النووي: ترنسفكأيشن نسب الكاشف هي الاستعمال الأمثل. استخدام أوصى المتوسطة ترنسفكأيشن تعتمد على طريقة ترنسفكأيشن، أي تعداء الدهون polycationic يوصي تخفيض أو عدم وجود مصل بقري الجنين وبالتالي يمكن استكمال وسائل الإعلام مع هرمونات النمو والعناصر النزرة لدعم النمو في غياب المصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة قوارير إلى 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 الحاضنة. لحجم 200 مل، استخدم 9 T-150 قوارير. يتم الاحتفاظ الخلايا في مستنبت ترنسفكأيشن حتى يوم الحصاد فلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف الثقافة الحصاد من الخلايا بعد 72-96 ساعة بعد ترنسفكأيشن اعتمادا على المستضد، أو عندما انخفض بقاء الخلية إلى 70-80٪، حسب تقديرات التفتيش المجهري. نقل طاف في أنابيب مخروطية 50 مل وتدور الخلايا في أسفل 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لتكوير الحطام الخلوية. ملاحظة: استبدال 3 طاف اليوم مع الطازج قبل تحسنت، وسائل الإعلام ترنسفكأيشن خالية من المصل إلى الخلايا الملتصقة سوف yielدا الكثير الثاني من VLPs مع العائد مماثل أو انخفاض طفيف، وينبغي أن يكون الأمثل من قبل المستخدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع طاف ومرشح من خلال غشاء 0.22 ميكرون المسام قبل الترسيب عبر تنبيذ فائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار التراص النشاط من VLPs HA معربا عن طريق معيار فحص التراص 14 باستخدام 0.8٪ الديك الرومي أو خلايا الدم الحمراء الثدييات أو المضي قدما مع مستضد معين ELISA. انظر الشكل 2 للحصول على نتائج تمثيلية. </li></ol> 2. تشيك فلب التعبير عن طريق نظام الخلايا الفيروسة العصوية / الحشرات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد الفيروسة العصوية المؤتلف التعبير قفيصة فيروس شيكونغونيا والبروتينات المغلف (C-E3-E2-6K-E1) من S-27 سلالة باستخدام نظام التعبير الفيروسة العصوية التجاري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا Sf9 الثقافة ورق القطن frugiperda في Sf9 متوسط ​​النمو خالية من المصل مع 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل عند 28 درجة مئوية. استخدام 3-5 × 10 5 ج / مل لبدء الثقافات الدوار قارورة لsuspensنمو الخلايا أيون. مرور روتينية عندما تصل كثافة خلية من 2-4 × 10 6 ج / مل (كل 3-4 أيام). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الثقافة Sf9 معلق في قوارير الدوار مع التحريك في 130 دورة في الدقيقة على نظام متعددة النمام لوحة. للتهوية المناسبة، الحفاظ على أحجام الثقافة في أي أكثر من نصف حجم القارورة الدوار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتعبير عن تشيك VLPs، ويصيب خلايا Sf9 في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 6 خلية / مل مع الفيروسة العصوية المؤتلف في عدد وافر من إصابة 1 والعودة إلى 28 درجة مئوية الحاضنة. عادة، ويصيب واحد أو اثنين من قوارير الدوار، تحتوي على 250 مل خلايا Sf9. ملاحظة: في حين أننا لا تستخدم هذا الأسلوب، وخلايا Sf9 قد يكون مثقف في قوارير شاكر عند 28 درجة مئوية باستخدام منصة شاكر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقافات الحصاد بعد 72-96 ساعة بعد الإصابة، أو عندما انخفض بقاء الخلية إلى 70-80٪ كما هو محدد من قبل الاستبعاد التريبان الأزرق وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ملاحظة: تواصل الخلايا على التكاثر حين المصابين وهناكوالجدوى ~ 80٪ في الثقافات Sf9 المصابين المؤتلف الفيروسة العصوية تشيك فلب في 3 أيام بعد العدوى (نقطة في البوصة). الخلايا المصابة الفيروسة العصوية أكبر في المظهر. مورفولوجيا قد تغير أيضا من جولة إلى مستطيل. في أواخر مراحل العدوى الفيروسة العصوية، بدأت الخلايا ليز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقافات نقل مباشرة من ثقافة تعليق في أنابيب مخروطية 50 مل وتدور الخلايا في أسفل 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع supernatants وتصفية من خلال الغشاء 0.22 ميكرون المسام قبل الترسيب عبر تنبيذ فائق. </li></ol> 3. الترسيب / تنقية فلب / SVPs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم 25 ملم × 89 ملم مكشوفة أنابيب نابذة مع 70٪ من الإيثانول في مجال السلامة الأحيائية غطاء محرك السيارة. ضمان قد جفت الإيثانول الكهربائي قبل استخدامه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل ما يصل إلى 32 مل من طاف في أنبوب نظيفة. ينصح حجم الحد الأدنى من 25 مل لمنع انهيار وتلف أنابيب نابذة شغل غير الكافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأساس الذي تقوم عليه بعناية supernatants خفة دمح معقم 3 مل 20٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني (ت / ت). تأكد من أنابيب متوازنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 135000 x ج لمدة 4 ساعات في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف، وضمان بيليه لا طرد من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend الرسوبية VLPs في الجزء السفلي من الأنابيب مع برنامج تلفزيوني العقيمة من قبل pipetting بقوة صعودا وهبوطا. كمية من برنامج تلفزيوني حاجة ل resuspend VLPs يعتمد على فلب محصول البروتين والتطبيقات المصب. عادة، resuspend كل بيليه فلب لا تقل عن 100 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين عينات 4 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى القصير و-80 ° C تخزين لتخزين على المدى الطويل. </li></ol> 4. تحديد العائد البروتين والعائد مستضد معين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد محتوى البروتين الكلي باستخدام طريقة البروتين الكمي التجاري، مثل فحص BCA حسب بروتوكول الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم محتوى مستضد معين، نفذ انزيم مرتبط مباشرة المناعي فحص (ELISA) من خلال طلاء التخفيفات المسلسل من المستضدات القياسية و2-51؛ غرام من إجمالي العينة البروتين الدخول إلى ELISA 96-جيدا لوحة مسطحة القاع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع مع الأجسام المضادة مستضد معين للتحقيق في وجود مستضدات على لوحة واستخدام ركائز التنمية ELISA التقليدية لإنتاج الامتصاصية للكشف عن قارئ صفيحة. انظر الشكل 2 لنتائج ممثلة من HA و ELISA فحص لعينة HA، معربا عن فلب. العديد من مجموعات من HA و NA هي ربما ولكن قد تختلف العوائد على HA-NA توافق 15. ملاحظة: الأجسام المضادة مستضد محددة لها الانتماءات المتغيرة وينصح أن نقطة النهاية تخفيف معايرة الأجسام المضادة يتم تحديدها قبل تنفيذ فلب الكمي. والأجسام المضادة التجارية لديها تركيز أو تخفيف نطاقات المقترحة للاستخدام في ELISA، وكذلك البروتوكولات المقترحة. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Zeltins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+virus-like+particles%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of virus-like particles: a review.</a> Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).</li>
<li>Jain, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+and+stabilization+of+recombinant+protein+based+virus-like+particle+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines.</a> Adv Drug Deliv Rev. , (2014).</li>
<li>Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+binding+and+pH+stability+-+how+influenza+A+virus+hemagglutinin+affects+host-specific+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engerix-B+package+insert%5BTitle%5D)+AND+%22GlaxoSmithKline%2C+Research+Triangle+Park%2C+NC%22%5BJournal%5D)">Engerix-B package insert.</a> GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).</li>
<li>Giles, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computationally+optimized+hemagglutinin+virus-like+particle+vaccine+elicits+broadly+reactive+antibodies+that+protect+nonhuman+primates+from+H5N1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection.</a> J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).</li>
<li>Giles, B. M., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computationally+optimized+broadly+reactive+antigen+%28COBRA%29+based+H5N1+VLP+vaccine+elicits+broadly+reactive+antibodies+in+mice+and+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets.</a> Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).</li>
<li>Green, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C3d+enhancement+of+neutralizing+antibodies+to+measles+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin.</a> Vaccine. 20, 242-248 (2001).</li>
<li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-Clade+Protective+Immune+Responses+to+Influenza+Viruses+with+H5N1+HA+and+NA+Elicited+by+an+Influenza+Virus-Like+Particle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle.</a> PLoS ONE. 3, e1501(2008).</li>
<li>Yondola, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+Capability+of+the+Influenza+Virus+Neuraminidase+Can+Be+Modulated+by+Tetherin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin.</a> J Virol. 85, 2480-2491 (2011).</li>
<li>Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-like+particles+for+antigen+delivery+at+mucosal+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).</li>
<li>Murawski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus-like+particles+containing+respiratory+syncytial+virus+G+protein+induced+protection+in+BALB%2Fc+mice%2C+with+no+evidence+of+immunopathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology.</a> J Virol. 84, 1110-1123 (2010).</li>
<li>Quan, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruslike+particle+vaccine+induces+protection+against+respiratory+syncytial+virus+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice.</a> J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).</li>
<li>Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COBRA-Based+Dengue+Tetravalent+Vaccine+Elicits+Neutralizing+Antibodies+Against+All+Four+Dengue+Serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vaccine+Immunotechnology%22%5BJournal%5D)">COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes.</a> J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).</li>
<li>Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).</li>
<li>Mitnaul, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balanced+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+Activities+Are+Critical+for+Efficient+Replication+of+Influenza+A+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus.</a> J Virol. 74, 6015-6020 (2000).</li>
<li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+DL+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 463, Academic Press. 191-222 (2009).</li>
<li>Pijlman, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enveloped+virus-like+particles+as+vaccines+against+pathogenic+arboviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses.</a> Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).</li>
<li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+efficacy+of+crude+virus-like+particle+vaccine+against+HPAI+H5N1+in+chickens+and+its+application+on+DIVA+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+Other+Respir+Viruses%22%5BJournal%5D)">Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy.</a> Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).</li>
<li>Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosafety+Recommendations+for+Work+with+Influenza+Viruses+Containing+a+Hemagglutinin+from+the+A%2Fgoose%2FGuangdong%2F1%2F96+Lineage.+MMWR.+Recommendations+and+reports+%3A+Morbidity+and+mortality+weekly+report%5BTitle%5D)+AND+%22Recommendations+and+reports+%2F+Centers+for+Disease+Control%22%5BJournal%5D)">Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report.</a> Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

وقد استخدمنا الأساليب المذكورة أعلاه للتعبير عن بنجاح وتنقية SVPs وVLPs تتكون من البروتينات الهيكلية المتعددة لمختلف مسببات الأمراض. بشكل عام، ونحن نستخدم أنظمة التعبير الثدييات لتوليد VLPs لدينا. ومع ذلك، في أيدينا، المستمدة من الثدييات خلية كانت تشيك عوائد فلب منخفضة. وكان تشيك العائد فلب أكثر قوة عند استخدام نظام خلية الفيروسة العصوية الحشرات المؤتلف. بشكل عام، الفيروسة العصوية الحشرات نظم خلايا تسفر عن كميات أكبر من البروتينات المؤتلف، التي قد تنجم عن كثافة الخلية العليا التي ...

جزيئات الفيروسات مثل (VLPs) هي تكنولوجيا معتمدة للتطعيم البشري. في الواقع، بعض اللقاحات المرخصة أكثر معاصرون، بما في ذلك فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) وΒ التهاب الكبد (HepΒ) اللقاحات تستخدم هذا النهج. تتشكل VLPs من البروتينات الهيكلية قادرة على التجميع الذاتي. الجسيمات تجميعها تحاكي الأشكال التضاريسية الفيروسية، ولكن لا يمكن أن تصيب أو تكرار لأنها تفتقر إلى الجينوم الفيروسي. VLPs يمكن التعبير عن وتنقيته من عدد من أنظمة بدائية النواة وحقيقية النواة. كشفت مراجعة للأدبيات التي نظم التعبير المختلفة ويعمل على أساس المعدلات التالية: البكتيريا - 28٪، الخميرة - 20٪، والنبات - 9٪، الحشرات - 28٪، والثدييات - 15٪ 1. من المذكرة، ويتم إنتاج لقاحات فيروس الورم الحليمي البشري على أساس L1 البروتين قفيصة في الخميرة (جارداسيل) أو في نظام خلية الحشرات (سيرفاريكس) 2. اللقاحات HepΒ، Recombivax وEngerix-Β، وتنتج أيضا في الخميرة، وتتألف من HepΒ سطح المستضد 3، 4. نحن نستخدم أنظمة التعبير خلايا الثدييات والحشرات لإنتاج VLPs تتطلب شارك في التعبير عن البروتينات الهيكلية متعددة للتجميع. يركز عملنا على تصميم وانتاج، ولقاحات من فلب تنقية ضد مسببات الأمراض البشرية: فيروس الإنفلونزا، الجهاز التنفسي المخلوي فيروس (RSV)، فيروس حمى الضنك (DENV)، وفيروس شيكونغونيا (CHIKV). طرقنا مرنة بما يكفي للسماح للمشاركة في التعبير عن البروتينات الهيكلية متعددة من البلازميدات التعبير متعددة، أو التعبير البلازميد واحد (الشكل 1). سابقا، وأنتجنا وتنقيته H5N1 VLPs تجميعها من شارك في التعبير عن البلازميدات ترميز هيماغلوتينين الإنفلونزا (HA)، النورامينيداز (NA)، ومصفوفة (M1) في الجنينية خلايا 293T الكلى البشرية 5،6. الجينات وكودون الأمثل للتعبير في خلايا الثدييات والمستنسخة في pTR600، ناقل التعبير حقيقية النواة تحتوي على الفيروس المضخم للخلايا فوري أوائل المروج بالإضافة إلى إنترون ألف لبدء transcription من إدراج حقيقية النواة والأبقار هرمون النمو إشارة تذييل بعديد الأدينيلات لإنهاء النسخ 7. تم استخدام نهج مماثل باستخدام ثلاث البلازميد شارك في التعبير عن HA، NA (الشكل 1A) والبروتين مصفوفة الفيروسي بديل، فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة P55، لجيل من البشر سلالة الانفلونزا الموسمية H3N2 VLPs في هذه الدراسة، ولقد ثبت لتوليد VLPs مشابهة من حيث الحجم على شكل جسيمات أنفلونزا 8. على الرغم من أن لقاحات الأنفلونزا تثير في الغالب الأجسام المضادة-HA، إضافة نورامينيداز الإنفلونزا تتوسط النشاط سياليداز لتمكين فلب في مهدها من خلايا transfected 9 و أيضا أهدافا مناعة إضافية الحالية. لإنتاج RSV VLPs، اخترنا أيضا جوهر لا علاقة لها من فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة لتصميم اللقاحات نموذجية التي تقدم بروتينات سكرية سطح RSV حصرا لمواصلة إبداء المرونة من تشكيل فلب باستخدام فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة، كما هو موضح سابقا والتي تتميز المجهر الإلكتروني 6،10. آخرونوقد أظهرت في وقت سابق ان VLPs تقديم بروتينات سكرية RSV يمكن تجميعها باستخدام مكونات فيروسية مختلفة من فيروس مرض نيوكاسل (نيوكاسل) 11، ومصفوفة أنفلونزا 12. واستخدمت كامل طول سطح تسلسل بروتين سكري في هذه الدراسة إلى الإبقاء على التشكل الأصلية التي قد تكون ضرورية لمستقبل وظيفي ملزمة والأجسام المضادة الاعتراف الفحص من خلال الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). لدينا أمثلة لاستخدام نظم التعبير البلازميد واحدة لتوليد الجسيمات DENV وCHIKV. في حالة DENV، فإننا يمكن أن تنتج جزيئات subviral (SVPs) مع عدم وجود القفيصة في الخلايا 293T من البلازميد واحد يحتوي على PRM / E الجينات الهيكلي التعبير كاسيت 13. يتم استخدام SVP المصطلح للدلالة على عدم وجود الأساسية أو قفيصة البروتين في تجميع البروتينات الهيكلية الفيروسية. ويمكن أيضا أن تنتج تشيك VLPs استخدام البلازميد واحد يحتوي على CHIKV كاسيت الجين الهيكلي، القفيصة الترميز والمغلف البروتينات، أو في الاولخلايا nsect عن طريق إصابة مع الفيروسة العصوية المؤتلف ترميز نفس كاسيت الجين الهيكلي الأمثل للتعبير عن خلية الحشرات (الشكل 1B - C). النتيجة النهائية للتعبير النهج التي نوقشت أعلاه هي الافراج عن VLPs إلى مستنبت الخلية التي يمكن بعد ذلك تنقيته عبر تنبيذ فائق من خلال 20٪ وسادة الجلسرين. في هذا التقرير، ونحن نقدم طرق للتعبير عن وتنقية هذه VLPs من أنظمة خلايا الثدييات والحشرات.

<table><tbody><tr><td>مجموعة البلازميد ماكسي</td><td>كياجين</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>تقنيات الحياة الليبوفيكتامين</td><td></td><td>L3000075</td><td>ليبوفيكتامين 2000 ، ليبوفيكتامين 3000</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies</td><td>31985062</td><td></td></tr> نظام <tr><td>التعبير عن الفيروسات العصبية Bac-to-Bac</td><td>تقنيات الحياة</td><td>10359-016</td><td></td></tr><tr><td>Cimarec I 6 لوحة نمام متعددة</td><td>النقاط ThermoFisher Scientific</td><td>50094596</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب الطرد المركزي الفائق Polyclear</td><td>Seton</td><td>7025</td><td>تأكيد الأنابيب المناسبة لأجهزة الطرد المركزي الفائقة وحجم الجرافة</td></tr> Micro BCA <tr><td>Protein Assay</td><td>Kit ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>عازلة سترات الفوسفات</td><td>Sigma</td><td>P4922</td><td></td></tr><tr><td>o-phenylenediamine ثنائي هيدروكلوريد&nbsp;</td><td>سيجما</td><td>P8287</td><td></td></tr><tr><td>0.22 & م أعلى مرشح فراغ (500 مل)</td> <td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sigma</td><td>339741&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SF-900 II SFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10902-096</td><td></td></tr></tbody></table>

التعبير وتنقية جزيئات تشبه الفيروسات للتطعيم

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

جزيئات الفيروسات مثل (VLPs) والجسيمات subviral (SVPs) هي مقاربة بديلة لتصميم لقاح فيروسي التي توفر مزايا زيادة السلامة الأحيائية والاستقرار على استخدام مسببات الأمراض الحية. غير المعدية وتجميع الذات، وتستخدم VLPs لتقديم البروتينات الهيكلية كما immunogens، تجاوز الحاجة لمسببات الأمراض حية أو ناقلات فيروسية المؤتلف للتسليم المستضد. في هذه المقالة، ونحن لشرح مراحل مختلفة من التصميم فلب والتنمية للتطبيقات المستقبلية في التجارب على الحيوانات قبل السريرية. ويشمل الإجراء المراحل التالية: مجموعة مختارة من مستضد والتعبير عن مستضد في خط الخلية في الاختيار، وتنقية VLPs / SVPs، وتقدير للمستضد الجرعات. ونحن لشرح استخدام كل من خطوط خلايا الثدييات والحشرات للتعبير عن المستضدات لدينا وإظهار كيف تختلف المنهجيات في العائد. قد يتم تطبيق منهجية عرضها على مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض ويمكن أن يتحقق عن طريق استبدال مولدات المضادات مع شارع مناعةالبروتينات uctural من الكائنات الحية الدقيقة المستخدم من الفائدة. VLPs وSVPs تساعد مع توصيف مستضد واختيار أفضل المرشحين لقاح.

وكانت غلة فلب المتغيرة التي كتبها الفيروسي تصميم مستضد بناء. في هذا البروتوكول، ونحن أثبتنا استخدام خلايا الحشرات والثدييات لإنتاج SVP أو VLPs في طاف وتنقية من قبل تنبيذ فائق. تم استخدام أربعة أنواع فرعية من DENV PRM / E الجينات الهيكلي أشرطة التعبير لبناء إصدارات DENV SVPs (ترسيمها كما 1-4) في الجدول 1 ويبرهن على وجود تتراوح ما بين 1،1-2،6 ملغ من البروتين الكلي في 0.6 مل وحدات التخزين. لVLPs التي تتطلب ثلاث بنيات الجينات، وجدنا ال...

هنا، نقدم بروتوكول لتجميع جزيئات تشبه الفيروس باستخدام الفيروسة العصوية أو الأنظمة التعبير الثدييات، وتنقية تنبيذ فائق. يستخدم هذا النهج عالية للتخصيص لتحديد المضادات الفيروسية كأهداف لقاح بطريقة آمنة ومرنة.

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تنقية الجسيمات الشبيهة بالفيروسات، أو VLPs، التي يتم التعبير عنها وإفرازها بواسطة أنظمة تعبير الخلايا الثديية أو الحشرية. يمكن لهذه الطريقة أن تجيب على أسئلة رئيسية في مجال اللقاحات، مثل كيفية التعبير عن المستضدات الفيروسية ذات الصلة التشكيلية وتنقيتا بطريقة آمنة ومرنة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب ترسيب البروتين باستخدام polyethylene glycol أو تحضير طبقات كثافة متعددة لتركيز VLPs.على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية متعمقة حول تحديد المستضدات الفيروسية كأهداف للقاحات، إلا أنه يمكن استخدام الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs) أيضاً كأدوات لتشخيص الأمراض والمصلات. ويُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث يصعب تعلم استخدام طبقة الجلسرول السفلية في خطوات إعادة تعليق الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs) لأن المبتدئين قد يفشلون في تطبيق التقنية الصحيحة. وفي يوم عملية النقل الجيني (transfection)، يتم تحضير محاليل الليبوزوم والحمض النووي DNA وفقاً لتوصيات الشركة المصنعة.قم بنقل الحمض النووي إلى الخلايا باستخدام تركيبة من الحمض النووي بنسبة تتراوح من 1:1 إلى 1:2 من HA إلى NA إلى Gag، وبكمية إجمالية من الحمض النووي تبلغ 40 micrograms لكل قارورة T150. كرر هذه الخطوة لتجهيز تسع قارورات T150، بحجم إجمالي قدره 200 milliliters. بعد ذلك، قم بتخفيف محاليل الحمض النووي والليبوزوم في وسط نقل خالٍ من المصل وخالٍ من المضادات الحيوية، بحيث تحتوي كل قارورة على حجم إجمالي قدره 24 milliliters.أعد الدوارق إلى الحاضنة وحافظ على الخلايا ووسط زراعة النقل (transvection) حتى يوم حصاد الجسيمات الشبيهة بالفيروسات، أو VLP. انقل الطافي إلى أنابيب مخروطية سعة 50 milliliter لحصد المزرعة من الخلايا بعد 72 إلى 96 ساعة من عملية النقل. قم بتدوير الخلايا لترسيب الحطام الخلوي.اجمع السوائل الطافية وقم بترشيحها عبر غشاء صب بمسامية 0.22 micron. ازرع خلايا spodoptera frugiperda، أو Sf9، التي تم تحضيرها مسبقاً، في معلق داخل دوارق دوارة، مع التقليب المستمر بسرعة 130 rpm على نظام لوح تقليب متعدد النقاط. حافظ على أحجام المزرعة بحيث لا تتجاوز نصف حجم الدوارق الدوارة لضمان التهوية المناسبة.بعد ذلك، يتم التعبير عن جسيمات CHIK الشبيهة بالفيروسات (VLPs) عن طريق إصابة 250 milliliters من خلايا Sf9 في دورق دوار بكثافة 2 × 10⁶ cells/milliliter باستخدام الفيروس الباكولي المؤتلف الذي تم تحضيره مسبقاً، ثم تُعاد الخلايا إلى حاضنة عند درجة حرارة 28 °C. استخدم اختبار استبعاد صبغة trypan blue لتحديد ما إذا كانت حيوية الخلايا قد انخفضت إلى 70 إلى 80%. وعند التأكيد، انقل المزارع مباشرة من المعلق إلى أنابيب مخروطية سعة 50 milliliter وقم بطرد الخلايا مركزياً للترسيب. اجمع السوائل الطافية وقم بترشيحها عبر غشاء ترشيح بمسامية 0.22 micron قبل عملية الترسيب.قم بتعقيم ستة أنابيب طرد مركزي فائق مفتوحة القمة مقاس 25 مليمتر في 89 مليمتر باستخدام ethanol بتركيز 70%. بعد ذلك، تأكد من جفاف ethanol تماماً. ثم قم بتعبئة 32 milliliters من السوائل الطافية في الأنابيب النظيفة.بعد ذلك، قم بإضافة ثلاثة ملليلتر من الجلسرول المعقم بتركيز 20% وPBS بعناية كطبقة سفلية تحت الطافوات. أضف الجلسرول ببطء لتجنب اختلال طبقة الكثافة الرقيقة بين الجلسرول ومحلول VLP. إن توزيع الجلسرول بسرعة كبيرة سيؤدي إلى اختلاط الجلسرول ومحاليل VLP، مما يقلل من ترسيب VLP.تأكد من توازن الأنابيب، ثم ابدأ عملية الطرد المركزي. بعد مرور أربع ساعات، أخرج الأنابيب من جهاز الطرد المركزي. قم بسحب السائل الطافي، مع الحرص على عدم تحريك الراسب من الأنبوب.أعد تعليق الجزيئات الشبيهة بالفيروسات (VLPs) المترسبة في قاع الأنابيب في 100 µL على الأقل من محلول PBS المعقم عن طريق السحب والطرد اللطيف والبطيء باستخدام الماصة. يجب إجراء عملية إعادة تعليق كتلة الـ VLP من خلال تكرار عمليات سحب وطرد محلول PBS ببطء ولطف باستخدام الماصة. تجنب تكوين الفقاعات للحد من فقدان الـ VLPs.أخيراً، يتم تخزين الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs) المعاد تعليقها. تم الحصول على أحجام الـ VLPs وعائد البروتين الكلي باستخدام مقايسة BCA التقليدية من مجموعة متنوعة من تركيبات SVP و VLP. تتراوح عوائد CHIK SVP من خلايا Sf9 بين 0.008 إلى 0.016 milligrams من البروتين الكلي لكل milliliter من حجم السائل الطافي.بينما يؤدي الإنتاج عبر خلايا 293 T الثديية إلى انخفاض في كمية البروتين بمقدار عشرة أضعاف. تُظهر صورة المجهر الإلكتروني هذه أنه تم التعبير بنجاح عن جزيئات الشبيهة بالفيروسات (VLPs) لنواة HA Gag للإنفلونزا، وتجميعها وتنقيتها كـ VLPs. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إجراء عملية النقل والعدوى للمزارع الخلوية السليمة والحيوية فقط، لأن ذلك سيؤثر على مستويات التعبير الإجمالية للبروتين.بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل مقايسات BCA وELIZA وHA لقياس محتوى البروتين الكلي، ومحتوى المستضد النوعي، وتعبير HA الوظيفي. لا تنسَ أن العمل بجهاز الطرد المركزي الفائق قد يكون خطيرًا، لذا يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة أثناء تنفيذ هذا الإجراء، مثل موازنة الأنابيب، واستخدام الدوارات والسرعات الموصى بها فقط، والإشراف المناسب على موظفي المختبر الجدد.

expression-and-purification-of-virus-like-particles-for-vaccination

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Fluorescence-Based Detection and Purification of Recombinant Vaccinia Virus

يوضح هذا الفيديو توليد جزيئات شبيهة بفيروس الأنفلونزا (VLPs) في نظام الثدييات. عند التعبير عن ثلاثة نواقل تعبير حقيقية النواة - تشفير بروتينات هيكلية فيروسية مختلفة - في الخلايا المضيفة المناسبة للثدييات ، تتجمع البروتينات الفيروسية المعبر عنها ذاتيا في VLPs على غشاء البلازما المضيف وتنطلق عن طريق التبرعم من سطح الخلية.

تقنية لتوليد جزيئات شبيهة بفيروس الأنفلونزا عبر نظام الثدييات

يوضح هذا الفيديو كيف تتولد الجسيمات الشبيهة بالفيروسات، VLPs عن طريق إصابة الخلايا الحشرية بفيروس باكوجو مؤتلف يحمل كاسيت جين فيروس الشيكونغونيا. يصيب الفيروس المؤتلف الخلايا ، مما يؤدي إلى تكوين VLP وتجميعه وإطلاقه في وسط الاستزراع لاستخدامه المحتمل في إنتاج اللقاح.

توليد جزيئات شبيهة بفيروس الشيكونغونيا باستخدام نظام التعبير عن الفيروس العصبي في خلايا الحشرات

ويرد هنا وصف بروتوكول سريع ووحدات لتوليد فيروسات vaccinia المؤتلفة التي تعبر عن البروتينات الموسومة الفلورية في وقت واحد باستخدام طريقة الاختيار المهيمن العابر.

منهجية لتوليد كفاءة من البروتينات فيروس Vaccinia الموسومة الفلورية

هنا، نقدم بروتوكول لتوليد نوع ثنائي التكافؤ اتش 5 (Ad5) ناقلات إثبات صحة المبدأ Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 من خلال الاستفادة من استراتيجية مستضد قفيصة التأسيس. وقد تجلى هذا متجه لعرض اللياقة البدنية النوعية، والقدرة على الهروب الأمصال Ad5 إيجابية في المختبر، واستضداد وكذلك المناعية لمستضدات يدمج.

استخدام استراتيجية قفيصة التأسيس Antigen ل تطوير المناهج اتش المصلي 5 تنقلها لقاح

فيروس جدري (VV) وقد استخدم على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية وتحسين صحة الإنسان. توضح هذه المقالة طريقة بسيطة وفعالة للغاية لتحرير الجينوم VV باستخدام نظام كريسبر-Cas9.

مقاربة بسيطة وفعالة لبناء ناقلات الفيروسات المسخ الوقس

وترد هنا طريقة مفصلة تصف تنقية الجسيمات النانوية البروتينية ذاتية التجميع (SAPNs) وإعادة طيها وتوصيفها لاستخدامها في تطوير اللقاحات.

إنتاج E.القولونية - أعرب الذاتي تجميع البروتين الجسيمات النانوية لللقاحات التي تتطلب عرض الإبإبيلة الانتهازية

هنا، يتم تقديم بروتوكول بسيط لإنتاج الجسيمات النانوية مرنا على أساس بولي (بيتا أمينويستر) البوليمرات، من السهل أن تكون مصممة عن طريق تغيير مرنا مغلفة. كما يتم وصف سير العمل لتجميع البوليمرات والجسيمات النانوية وتوصيفها الأساسي في المختبر. يضاف أيضا دليل على المفهوم فيما يتعلق بالتحصين.

تركيب وتوصيف متعدد الجسيمات النانوية المحملة بالحمض النووي الريبي (بيتا أمينوستر) لأغراض التطعيم

هنا، نقدم بروتوكولا للكشف عن إزالة الأسطح المحايدة على الجسيمات الشبيهة بالفيروسات التي تعرض المستضدات (VLPs). يتم إجراء التكاثر المناعي لفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) المشتقة من VLPs باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة الخاصة بالجظرات المظروفة إلى جانب الخرز المغناطيسي المقترن بالبروتين G. يتم إخضاع VLPs الملتقطة في وقت لاحق إلى SDS-PAGE والتحليل الغربي لللطخة باستخدام الأجسام المضادة للبروتين الأساسي الفيروسي Gag-specific.

الكشف عن Epitopes الحساسة للتحييد في المستضدات المعروضة على الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLP) المستندة إلى اللقاحات باستخدام م المقايسة التقاط

يصف البروتوكول الحالي الهندسة الحيوية للحويصلات الغشائية الخارجية بأنها منصة لقاح "التوصيل والعرض" ، بما في ذلك الإنتاج والتنقية والاقتران الحيوي والتوصيف.

منصة لقاح الجسيمات النانوية "التوصيل والعرض" القائمة على حويصلات الغشاء الخارجي التي تعرض مجال ربط مستقبلات SARS-CoV-2

تعلم تنقية جزيئات تشبه الفيروسات (VLPs) المُعبّرة في الخلايا الثديية أو الحشرية باستخدام الطرد المركزي الفائق. تُسهّل هذه الطريقة تحديد المستضدات الفيروسية كأهداف للقاحات بأمان ومرونة.

التعبير وتنقية جزيئات تشبه الفيروسات للتطعيم

استكشف المزيد من الفيديوهات