واحد خطوة السلبية الكروماتوغرافي تنقية

الهدف العام من عملية التنقية هذه هو الحصول على بروتين تنشيط الخلايا المتعادلة لجرثومة الملوية البوابية (Helicobacter pylori Neutrophil-activating protein) أو HP-NAP في صورته الأصلية بنقاء عالٍ وإنتاجية عالية باستخدام كرمتوغرافيا الدفعات ذات النمط السلبي مع راتنج التبادل الأيوني ثنائي إيثيل أمينو إيثيل (di-ethyl amino-ethyl). وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تنقية HP-NAP في صورته الأصلية في خطوة واحدة وبنقاء وإنتاجية عاليين. تبدأ التنقية السلبية لبروتين HP-NAP بإجراء ربط دفعي يتم فيه إضافة جزء البروتين القابل للذوبان من نواتج تحلل البكتيريا إلى راتنج DEAE.

يتم تحضين الخليط للسماح للبروتينات الكلية بالارتباط بالراتنج. بعد ذلك، يتم الحصول على HP-NAP الموجود في الجزء غير المرتبط عن طريق الطرد المركزي أو التدفق بالجاذبية. وتتمثل تطبيقات هذه التقنية في العلاج الوقائي بنسبة 10:1 والتشخيصات المسبقة للأمراض المرتبطة بـ Helicobacter pylori بالإضافة إلى علاج السرطان.

بسبب الخصائص المناعية والمعدلة للمناعة لـ HP-NAP. وبشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة، نظراً لأن HP-NAP يتكتل بسهولة أثناء التعقيم.

سيقوم بتوضيح الإجراء Zhi-Wei Hong، وهو طالب دراسات عليا من مختبرنا. أثناء العمل في درجة حرارة 4 °C، نقوم بتعليق 50 milliliters من عجينة الخلايا المحضرة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب في 20 milliliters من tris-buffer منخفض الملوحة عند pH 9.0 مع خليط مثبط البروتياز. ومن الضروري الحفاظ على العينة عند درجة حرارة 4 °C للسماح للإجراء بمنع تكتل البروتين.

قم بتفكيك الخلايا البكتيرية عن طريق تمرير المعلق البكتيري عبر مجانس عالي الضغط يعمل في نطاق من 15,000 إلى 20,000 PSI لسبع مرات عند درجة حرارة 4 °C. وبمجرد تحلل البكتيريا، يجب إجراء عملية الطرد المركزي فوراً. انقل العينات المتجانسة إلى أنبوب طرد مركزي.

قم فوراً بطرد مركزي لمحلول تحلل الخلايا بسرعة 30,000 ×g عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة واحدة لفصل كسور البروتين الذائبة وغير الذائبة باستخدام جهاز طرد مركزي فائق السرعة. بعد عملية الطرد المركزي، انقُل الرائق، والذي يمثل كسر البروتين الذائب، إلى دورق. قم بقياس تركيز البروتين في كسر البروتين الذائب باستخدام طريقة برادفورد (Bradford method) عبر طقم تجاري، مع استخدام ألبومين المصل البقري كمعيار وفقاً لإرشادات الشركة المصنعة.

بعد ذلك، أضف 177.6 µL من HCl العادي إلى 20 mL من جزء البروتين القابل للذوبان لضبط قيمة pH من pH 9.0 إلى pH 8.0. أضف Tris-HCl بتركيز 20 mM، pH 8.0، وكلوريد الصوديوم بتركيز 50 mM إلى محلول البروتين للوصول إلى تركيز نهائي للبروتين يبلغ 0.5 mg/mL. ولتحضير 15 mL من راتنج DEAE، قم بتعليق 0.6 g من مسحوق راتنج DEAE الجاف في 30 mL من محلول Tris-HCl المنظم في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم واحد على الأقل.

قم بطرد الراتنج مركزياً بسرعة 10,000 ×g عند درجة حرارة 4 °C لمدة دقيقة واحدة، ثم قم بإزالة السائل الطافي والتخلص منه. بعد ذلك، أضف 15 milliliters من منظم Tris-HCl. وبعد تكرار خطوات الطرد المركزي وإعادة التعليق أربع مرات إضافية، احفظ الـ 15 milliliters من الراتنج المترسب عند درجة حرارة 4 °C لاستخدامها لاحقاً.

عند العمل في درجة حرارة 4 °C، أضف 45 ml من البروتينات الذائبة المُحضرة إلى ml من الراتنج وانقل الخليط إلى دورق سعة 100 ml يحتوي على قضيب تحريك. قم بتحريك ملاط البروتين والراتنج باستخدام لوح تحريك عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، صب ملاط البروتين والراتنج في عمود بلاستيكي أو زجاجي مزود بصنبور، واترك الراتنج يترسب بفعل الجاذبية.

افتح صنبور التصريف للسماح للمحلول البروتيني بالمرور عبر العمود بفعل الجاذبية حتى يصل مستوى السائل في العمود إلى ما فوق الراتنج مباشرة. اجمع السائل المار كجزء غير مرتبط يحتوي على البروتين المنشط للعدلات المنقى. أضف 15 milliliters من منظم Tris-HCl المبرد بالثلج إلى العمود.

افتح الصنبور مرة أخرى للسماح لمحلول الغسل بالتدفق عبر العمود بفعل الجاذبية حتى يصبح مستوى السائل في العمود فوق الراتنج مباشرةً. اجمع السائل المتدفق باعتباره جزء الغسل. كرر عملية الغسل باستخدام محلول منظم مبرد بالثلج أربع مرات إضافية لجمع أجزاء الغسل الإضافية.

ثم أضف 15 milliliters من 20 millimeter Tris-HCl pH 8.0 و one molar sodium chloride المبرد بالثلج إلى العمود. اجمع السائل المار كأجزاء شطف كما سبق. كرر خطوات الشطف أربع مرات إضافية لجمع أجزاء الشطف الإضافية.

يظهر هنا تأثير الأس الهيدروجيني (pH) على ذوبانية HP-NAP في مستخلص خلايا E.coli. وقد ازدادت كمية HP-NAP المكتشفة في هذا الجزء الذائب بشكل ملحوظ عند pH 7.5 إلى 9.5. كما تم استعادة البروتين المؤتلف HP-NAP بشكل كامل تقريبًا في الجزء الذائب عند تحلل الخلايا عند pH 9.0.

يتم هنا عرض تأثير الرقم الهيدروجيني (pH) على التنقية السلبية لبروتين HP-NAP المؤتلف الذي تم التعبير عنه في بكتيريا E.coli باستخدام راتنجات DEAE في نمط الدفعة. عند pH 8.0، تواجدت كمية ضئيلة فقط من HP-NAP في كسر الاستخلاص. وكانت كمية HP-NAP الموجودة في الكسور غير المرتبطة هي الأعلى عند pH 8.0.

تبلغ الكمية المثلى من البروتينات التي يتم تحميلها على راتنج DEAE مقدار 1.5 مليجرام من البروتين لكل ملليلتر من الراتنج لتحقيق السعة القصوى للراتنج في امتصاص الشوائب من بكتيريا E.coli. وعند pH 8.0، يتم استرداد عدد قليل جداً من البروتينات بخلاف HP-NAP في شكله الأصلي في الجزء غير المرتبط باستخدام راتنجات DEAE في نمط الدفعة. وقد بلغت نقاوة HP-NAP أكثر من 95 بالمائة.

ينطوي بروتين HP-NAP المنقى إلى شكل متعدد القسيمات (multimer) ذو بنية ثانوية من نوع لولب ألفا (alpha-helix)، كما كشف مخطط كروماتوجرام الترشيح الهلامي وطيف الدوران الضوئي الدائري في منطقة الأشعة فوق البنفسجية البعيدة. ويكشف مقايسة التألق الكيميائي المعتمد على التجويف أن بروتين HP-NAP المنقى قادر على تحفيز إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة الخلايا المتعادلة. وبمجرد إتقان هذه التقنيات، يمكن إجراؤها في غضون خمس ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تنقية بروتين HP-NAP الوظيفي في شكله الأصلي بإنتاجية ونقاوة عاليتين باستخدام تقنية الكروماتوغرافيا الدفعية بالنمط السلبي باستخدام DEAE وراتنج التبادل. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام محاليل منظمة ذات pH مناسب في خطوة التعقيم ضمن الكروماتوغرافيا الدفعية. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما حاولنا تطبيق نهج كروماتوغرافي آخر بدلاً من الترشيح لتنقية HP-NAP في شكله الأصلي.

على الرغم من أن هذه الطريقة مصممة للتنقية باستخدام بروتين HP-NAP المؤتلف الذي يتم التعبير عنه في بكتيريا E.coli، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة التعبير البكتيرية الأخرى مثل per-sida sep-tidas. ويكون العرض المرئي لهذا الإجراء سريع التنفيذ.

علاوة على ذلك، فإن خطوة التعقيم وكروماتوغرافيا الدفعات يصعب تعلمهما؛ نظرًا لضرورة تنفيذ هذه الخطوات عند درجة حرارة 4 °C دون أي تأخير زمني. وإذا كان البروتين المصمم للتنقية مناسباً للكروماتوغرافيا التبادلية في الوضع السالب، فيمكن تكييف هذا الإجراء أيضاً كنقطة انطلاق لتطوير عملية التنقية.

بعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأبحاث السريرية لاستكشاف إمكانية استخدام HP-NAP في علاج السرطان، وكذلك تطوير اللقاحات والأدوية والتشخيصات للأمراض المرتبطة بـ Helicobacter pylori.