تشكيل عملاق الحجم Polymersomes عن طريق الإماهة بمساعدة جل

الهدف العام من طريقة الإماهة بمساعدة الهلام هو تكوين حويصلات بوليمر عملاقة أحادية الصفيحة سليمة يمكن التحكم فيها بسهولة في توزيع حجم الحويصلة. توفر هذه الطريقة بديلا قويا لتكوين حويصلات البوليمر ، والتي يمكن استخدامها للتحقيق في الخصائص الفيزيائية للغشاء ثم دمج تلك الحويصلات في تطبيقات الهندسة الحيوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على إنتاج المئات من حويصلات البوليمر العملاقة السليمة بسهولة بسرعة أكبر وبطريقة أقل كثافة في العمالة من التقنيات التقليدية.

لذلك ، جاءت فكرة ذلك عندما علمنا بتقنية الإماهة بمساعدة الهلام لتشكيل حويصلات دهنية عملاقة. ومع ذلك ، فإن أساليبنا الحالية لتشكيل البوليمرات العملاقة تمثل تحديا وغالبا ما تكون منخفضة الغلة ، لذلك قررنا استخدام هذه المنهجية كنهج بديل. ابدأ تحضير محلول البوليمر عن طريق تحريك خمسة ملليغرامات من البوليمر ثنائي الكتلة PEO-PBD في مليلتر واحد من الكلوروفورم في قارورة زجاجية حتى يذوب تماما.

أضف محلول خمسة ملليغرام لكل مليلتر من البوليمر والكلوروفورم ومحلول واحد ملليغرام لكل مليلتر من الدهون والكلوروفورم المسمى بالفلورسنت إلى قارورة جديدة حتى يتم الحصول على تركيز نهائي من 99.5 مول في المائة من البوليمر و 0.5 في المائة من الدهون. لتقليل التبخر ، انقل محلول البوليمر إلى قارورة محكمة الإغلاق بغطاء مقاوم للكلوروفورم ، وقم بتخزينه على حرارة 20 درجة مئوية لاستخدامه لاحقا. لبدء تحضير فيلم الاغاروز ، أضف 50 مل من الماء و 0.5 جرام من الاغاروز القياسي إلى قارورة Erlenmeyer سعة 250 مل.

يغلي لمدة دقيقة واحدة باستخدام الميكروويف. قبل المتابعة ، قم بتبريد محلول الاغاروز إلى ما بين 65 و 75 درجة مئوية لمنع ضعف الالتصاق أو التكتل. بعد ذلك، قم بقص طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر واستخدمها لسحب 300 ميكرولتر من محلول الاغاروز على زلة غطاء زجاجي مربعة سعة 25 ملليلترا.

أثناء ارتداء القفازات، أمسك حافة زلة الغطاء وافرد الاغاروز بالتساوي على السطح بالكامل باستخدام الحافة الطويلة لطرف ماصة آخر سعة 1000 ميكرولتر. ضع جانب الغطاء من الاغاروز لأعلى على البارافيلم واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. استمر في سحب 30 ميكرولترا من محلول البوليمر المعد مسبقا على زلة الغطاء المطلية بغشاء الاغاروز.

أمسك حافة انزلاق الغطاء بأصابع مرتدية القفازات وانشر محلول البوليمر فوق فيلم الاغاروز بحركة دائرية باستخدام الحافة الطويلة لإبرة قياس 18. قم بإنهاء وضع جانب بوليمر زلة الغطاء لأعلى في طبق بتري بلاستيكي داخل مجفف الفراغ. قم بإخلاء المجفف لمدة ساعة واحدة على الأقل لإزالة أي مذيب متبقي.

لتشكيل البوليمرات ، قم أولا بلصق غطاء جيدا على جانب البوليمر من زلة الغطاء المطلي بالضغط برفق حتى يتم تشكيل ختم محكم. ثم أضف 200 إلى 500 ميكرولتر من محلول الجفاف إلى الغرفة. بعد ذلك ، ضع منديلا مبللا ملفوفا على طول الحافة الداخلية لطبق بتري زجاجي لتشكيل غرفة رطوبة.

ضع زلة الغطاء مع الغطاء الملتصق جيدا في الطبق وقم بتغطيته بغطاء. قم بتغطية طبق بتري بورق الألمنيوم لتقليل تبييض الصور ثم ضعه على طبق ساخن على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل لإكمال تكوين البوليمر. لبدء عملية التصوير FRAP ، ضع زلة الغطاء مع الغطاء الملتصق جيدا على مسرح المجهر الفلوري المقلوب المزود بمكثف قابل للتعديل.

بعد ذلك ، حدد مجموعة مرشحات بناء على الدهون الفلورية المستخدمة ولتصوير البوليمرات على السطح العلوي لانزلاق الغطاء باستخدام هدف زيت 100X. لتوصيف سيولة الغشاء باستخدام FRAP ، ركز أولا على البوليمر ، ثم أغلق مكثف المجهر بفتحة صغيرة وتأكد من أن حواف البوليمر تقع داخل مجال الصورة. بعد ذلك ، قم بزيادة تعرض الكاميرا ، وقم بإزالة جميع مرشحات الكثافة المحايدة واسمح للمنطقة محل الاهتمام بتبييض الصورة لمدة 30 إلى 60 ثانية.

أخيرا ، أطفئ المصباح وافتح المكثف بالكامل. قلل من التعرض لإعدادات البدء والتقط الصور كل 30 ثانية لمدة ثلاث دقائق. افتح برنامج تحليل الصور على كمبيوتر المجهر وقم بتحميل الصور المكتسبة للبوليمرات

قم بتعيين مقياس القياس عن طريق فتح القائمة المنسدلة تحليل وتحديد خيار تعيين المقياس. أدخل وحدات المعايرة المناسبة للمسافة بالبكسل والمسافة المعروفة ووحدة الطول، ثم حدد موافق. بعد ذلك ، استخدم صندوق أدوات الخط وارسم خطا يمتد على قطر بوليمر محدد.

قم بقياس قطر البوليمر عن طريق فتح القائمة المنسدلة تحليل وتحديد قياس. للمساعدة في التحليل ، استخدم التحكم بالإضافة إلى D لطباعة خط القياس على الصورة قبل الانتقال إلى البوليمر التالي. استمر في قياس البوليمرات باستخدام الإجراء أعلاه وإضافة كل قياس إلى نافذة البيانات حتى يكتمل.

أخيرا ، احفظ البيانات بالنقر فوق ملف وحفظ باسم.انقر فوق حفظ في النافذة التي تفتح ثم افتح ملف النتائج كجدول بيانات لتحليل البيانات. تم تصوير البوليمرات المكونة من أغشية البوليمر PEO-PBD المعاد ترطيبها بمخازن مؤقتة مختلفة باستخدام الفحص المجهري الفلوري. تظهر الصور أن البوليمرات غير متجانسة الحجم في ظل ظروف الجفاف المختلفة بقطر أقل عادة من 10 ميكرومتر.

تظهر صور التألق العرضي للبوليمرات المتكونة في الماء عند درجات حرارة مختلفة أنه مع زيادة درجة حرارة الجفاف ، تتشكل بوليمرات أكبر. تم حساب متوسط أقطار أكثر من 100 بوليمر تشكلت في الماء عند درجات حرارة مختلفة للإماهة. عند 24 درجة مئوية ، كان متوسط القطر 2.93 ميكرومتر ، ويرتفع حتى 14.04 ميكرومتر عند 70 درجة مئوية.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعة واحدة تقريبا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على البوليمرات في المحلول في جميع الأوقات. تأكد من أن بئر الغطاء متصل بإحكام بزلة الغطاء لتجنب تسرب محلول الإماهة وتجفيف البوليمصورات.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق مثل المجهر الإلكتروني لفهم الخصائص الهيكلية الإضافية للبوليمرات تمهد هذه التقنية الطريق للبحث في البيولوجيا التركيبية والهندسة الحيوية لاستكشاف البوليمرات كبديل قوي وقابل للتخصيص كيميائيا للأغشية الدهنية للبحث والواجهة اللاأحيائية الحيوية وأبحاث توصيل الأدوية وأنظمة الخلايا الأولية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تكوين البوليمرات العملاقة بقوة باستخدام الإماهة بمساعدة الهلام ، وضبط الحجم الكلي للحويصلات وتوصيف سلامة الغشاء.

لا تنس أن العمل مع الكلوروفورم أو الاغاروز والإبر يمكن أن يكون خطيرا. انتبه جيدا أثناء تنفيذ هذه الإجراءات. اتخذ الاحتياطات مثل العمل في غطاء الدخان واستخدم النظارات الواقية والقفازات في جميع الأوقات.