تشريح وشقة-تصاعد للThreespine أبو شوكة الخيشومي الهيكل العظمي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تشريح وتثبيت الهيكل الغلصمي لسمكة Stickleback بشكل مسطح. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات النمو وعلم الوراثة والتطور، مثل كيفية تكيف الحيوانات مع البيئات الجديدة وكيفية ظهور التباين في المورفولوجيا البالغة أثناء مرحلة النمو.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنه من خلال تشريح الهيكل الغلصمي وتثبيته بشكل مسطح، يمكن للمرء معاينة مجموعة متنوعة من السمات الغذائية التي لا يمكن دراستها في العينات الكاملة. كجزء من التحضير، قم بمراجعة المورفولوجيا ذات الصلة للهيكل العظمي للرأس في سمكة stickleback ثلاثية الأشواك. بعد تحضير السمكة للتشريح، ابدأ بإدخال ملقط حاد رقم 5 في جانب العين، بزاوية 45 درجة لثقب الغشاء الذي يغطي العين.

بعد ذلك، قم بإزالة غشاء العين، كما لو كنت ترفع غطاء علبة زبادي. ثم، أدخل ملقطاً مفتوحاً خلف العين، وأمسك بالعصب البصري، ثم استخرج العين. توخ الحذر لتجنب ثقب العين، وإلا سيتسرب منها الميلانين.

كرر هذه العملية مع العين في الجانب المقابل. بعد ذلك، ضع شفرة مقص صغير تحت الجانب الخلفي للسديلة الغطائية، واقطع من خلال الأنسجة الرخوة ظهرياً فوق الغطاء، باتجاه محجر العين. ثم اقطع من خلال العظم الجبهي، الذي يقع ظهرياً بالنسبة لمحجر العين.

بعد ذلك، قم بالقص عبر الخط المتوسط لعظم شبه الوتد، حول مركز محجر العين. كرر قص الغطاء الغلصمي على الجانب المقابل. بالنسبة للخطوات التالية، يمكن استخدام الأشواك الحوضية كمقابض.

يتم فردها عن طريق سحبها برفق بعيداً عن الجسم. الآن، أدخل الملقط تحت الغطاء، وقم بتقشير الوجه ببطء بعيداً عن الجسم، مع تقليم أي أنسجة رخوة لا تزال ملتصقة أثناء هذه العملية.

توخَّ الحذر عند التعامل مع المصفّيات الخيشومية، واحرص على عدم إتلافها. من السهل الإمساك بعظم الغصن الخيشومي الأول عن طريق الخطأ، جنباً إلى جنب مع الغطاء الخيشومي عند إزالة الهيكل الوجهي. انظر أسفل الغطاء الخيشومي أثناء تقشيره للأمام للتأكد من أنك لم تمسك بأي شيء إضافي.

الآن، وباستخدام الملاقط، افصل العظام القرنية الزجاجية (ceratohyals) من كلا جانبي العظم القاعدي اللساني (basihyal) الموجود في الخط المتوسط، مع تقشير وإزالة الهيكل القحفي الوجهي الأمامي. كرر العملية على الجانب المقابل. يشمل الهيكل القحفي الوجهي الأمامي الفك بالكامل، وهيكل العظم اللامي بالكامل، والعناصر الظهرية والغضروفية الكامنة تحته، والجزء الأمامي من الجمجمة.

بعد ذلك، أدخل ملقطاً مغلقاً أسفل أنبوب الأمعاء مباشرة، واسحبه باتجاه الجهة الأمامية، مع فصل العضلات والأربطة المتبقية المتصلة بالهيكل الخيشومي أثناء هذه العملية. ثم استخدم طرف الملقط المغلق لكشط العضلات التي تربط الهيكل الخيشومي الظهري بالغلاف البطني للدماغ.

قم بالكشط بحركة من الخلف إلى الأمام. كرر عملية إزالة العضلات على الجانب المقابل من سمكة الشوك. بعد ذلك، قم بإزالة الهيكل الخيشومي عن طريق الإمساك بقاعدة القناة المعوية والسحب باتجاه الأمام.

افصل الأنبوب المعوي باستخدام قطع عمودي، خلف العظم الغلصمي الخامس. ومن الأخطاء الشائعة الإمساك بالأنبوب المعوي في نقطة أمامية للغاية، مما يترك الأنبوب الجبهي البطني في الخلف. تأكد من الإمساك بالأنبوب في عمق المنطقة الخلفية من التجويف الصدري، حيث يمكنك دائماً إزالة الجزء الزائد من الأنبوب المعوي لاحقاً.

بعد إزالة أي شظايا عظمية متبقية من صندوق الدماغ على الجانب الظهري للهيكل الغلصمي، أدخل المقص في السلة الغلصمية، وأجرِ قطعاً ظهرياً بين المجموعات الثنائية من الصفائح السنية الظهرية. حافظ على جعل هذا القط مركزياً لتجنب إلحاق الضرر بالصفائح السنية الظهرية.

بعد ذلك، قم بإجراء شقين جانبيين سطحيين في تجويف الأمعاء المطاطي عند الطرف الخلفي للهيكل الخيشومي. وعند الطرف الأمامي لأنبوب الأمعاء، وذلك للمساعدة في فتح الهيكل الخيشومي.

الآن، انقل الهيكل العظمي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 50% glycerol و 0.25% potassium hydroxide لإجراء عملية ترويق لطيفة. أو بدلاً من ذلك، انقله إلى glycerol نقي إذا لم تكن هناك حاجة لمزيد من الترويق. وفي حال كانت هناك حاجة لإعادة الصبغ، فإن التفاصيل موضحة في البروتوكول النصي.

للاستعداد للتثبيت، استبدل المحلول بـ glycerol نقي، ورج الأنبوب لمدة خمس دقائق على الأقل. بعد ذلك، قم بإزالة الهيكل الخيشومي وضعه بالقرب من الجزء السفلي من شريحة غطاء زجاجية بمقاس 22 في 60 مليمتر بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى. الآن، انقل بضع قطرات من glycerol فوق الهيكل.

بعد ذلك، قم بتشكيل كرتين صغيرتين من صلصال النمذجة، وضع واحدة عند كل طرف من طرفي غطاء الشريحة، حيث تعملان كفواصل. ثم، ضع غطاء شريحة ثانٍ برفق فوق العينة، مع تطبيق ضغط كافٍ لتسطيح الهيكل الخيشومي الأمامي. الآن، قم بتقشير السديلة الظهرية اليسرى، بما في ذلك صفائح الأسنان الظهرية، ومرر السديلة بين غطائي الشريحة.

ثم قم بتطبيق الإجراء ذاته على السديلة الظهرية اليمنى. وادفع الهيكل الخيشومي بالكامل بعيداً عن حافة غطاء الشريحة. ولإتمام العملية، اضغط برفق على غطاء الشريحة العلوي لتسطيح كرات الصلصال.

بقدر كافٍ فقط للحفاظ على الهيكل الخيشومي مثبتًا بشكل مسطح، ولكن ليس لدرجة تؤدي إلى سحقه. إذا حُجبت صف من المكاكش خلال هذه العملية، فاستخدم الملاقط للإنزلاق بين شرائح التغطية وإعادة توجيه العظم الخيشومي أو العينة بأكملها.

عند التثبيت المسطح في الجلسرول النقي، يمكن تخزين العينة بشكل مسطح في درجة حرارة الغرفة لمدة عقد من الزمن على الأقل. ينتج عن هذا البروتوكول هيكل خيشومي مُشرح ومثبت بشكل مسطح، حيث يمكن من خلاله توثيق مجموعة متنوعة من السمات الغذائية الهامة زمنياً.

من منظور ظهري، يمكن رؤية جميع صفوف المصفّيات الخيشومية، وجميع الصفائح السنية البلعومية، وتقريباً جميع العظام الغلصمية بوضوح وتوثيقها زمنياً. كما يظهر Alizarin red S فلورية عند استخدام مرشح رودامين أو مرشح أحمر مماثل، مما يسمح بالوسم المزدوج مع علامات أخرى واستخدام طرق بديلة للتصور. في هذه الصورة، تم تحديد المصفّيات الخيشومية بعلامات رأس السهم (carats).

تم تحديد الأسنان برؤوس أسهم، بينما تم تحديد العظام بنجوم. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إجراء التشريح في غضون دقائق قليلة وتطبيقه على مئات الحيوانات بسرعة نسبية. وبينما قمنا بتوضيح تشريح الهيكل الغلصمي لسمكة الشوك (stickleback)، فإننا نأمل أن يُستخدم هذا الإجراء كدليل لمجموعة متنوعة من أنواع الأسماك.

من خلال تشريح الهيكل الخيشومي، يمكننا تصور مجموعة متنوعة من السمات الغذائية الهامة بسرعة وسهولة، والتي لا تكون مرئية في العينات الكاملة، مما يتيح فهماً أفضل لتطور وتطور الهيكل القحفي الوجهي.