تصميم وتطوير أبتمر الذهب الجسيمات النانوية وبناء اللونية فحوصات للتطبيقات الموجودة على الشبكة العالمية الحقل

الهدف العام هو توفير نهج عام لتطوير اختبار لوني قائم على جسيمات أبتامر-ذهب للكشف عن الجزيئات المستهدفة، وتوفير طرق لتحسين التخزين طويل الأمد وتقليل معدلات الاستجابة الإيجابية الكاذبة. تجيب هذه الطريقة على أسئلة رئيسية في مجال اختبارات الألوان لأبتامر جسيمات الذهب النانوية مثل قابلية تكرار هذه الاختبارات في الميدان للتخزين طويل الأمد وتقليل معدل الاستجابة الإيجابية الكاذبة. قد تكون هذه الاختبارات عرضة لمشاكل في عمر الصلاحية وردود فعل إيجابية خاطئة.

في هذا العمل، نحسن في كلا القضبين. نظف قارورة إيرلنماير بسعة 500 ملليتر وقضيب تحريك كبير بخمسة ملليتر من حمض النيتريك المركز و15 ملليتر من حمض الهيدروكلوريك المركز داخل غطاء أمان كيميائي. بلل سطح القارورة بالكامل بغسول الحمض.

ثم اشطف القارورة بماء خال من النوكلياز ودع القارورة تجف. أضف 100 ملليلتر من الذهب الميلي مول وثلاثة كلوريد. استخدم ورقة من ورق الألمنيوم لتغطية سطح قارورة إيرلينماير المنظفة بالحمض، وسخنها مع التحريك المستمر على صفيحة ساخنة حتى تغلي.

بعد ذلك، أضف 10 ملليلتر من سترات الصوديوم بوزن 38.8 ملليمول. يتغير اللون من الشفاف أو الرمادي إلى الأزرق الداكن أو الأسود، وأخيرا إلى الداكن إلى الأحمر خلال عدة دقائق. استمر في التحريك مع إطفاء النار لمدة 10 دقائق.

دع نظام تعليق الجسيمات النانوية الذهبية يبرد إلى درجة حرارة الغرفة وأضف 110 ميكرولتر من DEPC مع التحريك المستمر. غط القارورة بالكامل بورق الألمنيوم ودع معالجة DEPC تنمو طوال الليل. في اليوم التالي، قم بتعقيم نظام التعليق النانوي الذهبي.

ثم يبرد إلى درجة حرارة الغرفة ويقوم بالترشيح عبر غشاء أسيتات السليلوز المسام بحجم 0.22 ميكرون. خزن محلول جسيمات الذهب النانوية المفلتر والمتقمص في الظلام عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. احسب تركيز الجسيمات النانوية الذهبية كما هو موضح في بروتوكول النص.

هنا، تم حساب التركيز ليكون 10 نانومولار بحجم 15 نانومتر كما يحدده تشتت الضوء الديناميكي. شراء أو تصنيع تسلسلات الأبتامر المرتبطة بالكوكايين باستخدام كيمياء الفوسفوراميدات القياسية. بعد تنقية الأبتامرات باستخدام إزالة الملح القياسية، أعد تشكيل الأوليجونوكليوتيدات في مياه خالية من النوكلياز إما بمحاليل 100 ميكرومولر أو واحد مليمول.

يمكن تخزين الأبتامرات المنقاء المألوفة على 20 درجة مئوية لعدة أشهر. ادمج الحمض النووي مع محلول جسيمات الذهب النانوية المكونة من 10 أضرار نانومولار، مع تغيير حجم جسيمات الذهب حسب الرغبة، لتوفير عينة كافية لإجراء الاختبار. حضن الخليط لمدة ثلاث إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة وحميه من الضوء.

أضف حجما متساويا يبلغ 20 ملليمولر HEPES، وكلوريد المغنيسيوم المغنيسيمي الميلي مول، ومخزن pH 7.4، وضع العينة عند أربع درجات مئوية في الظلام طوال الليل. يتم تحديد التركيز الأولي للملح اللازم لتحفيز استجابة لون الاختبار بواسطة معايرة الملح باستخدام فراغ الاختبار. أضف 20 ميكرولتر من الميثانول إلى 180 ميكرولتر من تحليل كلوريد الذهب الأبتامري في صفيحة تحتوي على 96 بئرا.

خطوة حاسمة في أداء هذه الاختبارات هي تحديد تركيز كلوريد الصوديوم لزعزعة استقرار جسيمات الذهب النانوية بمجرد إضافة الهدف. قم بتعديل العينات بأحجام متزايدة من محلول كلوريد الصوديوم الأصلي وتحديد نقطة التكافؤ. هنا، حدد حجم كلوريد الصوديوم اللازم لإحداث أدنى تغير في اللون من خلال الملاحظة البصرية.

لتحسين استجابة الاختبار، أضف 20 ميكرولتر من جزيئات التحليل المخففة في الميثانول إلى 180 ميكرولتر من اختبار جسيمات أبتامر-ذهب النانوية في صفيحة بسعة 96 بئر في درجة حرارة الغرفة. على الفور، أضف تركيز كلوريد الصوديوم الذي تم تحديده في الخطوة السابقة لبدء استجابة لون الاختبار. الحصول على أكبر تغيير في اللون ممكن عن طريق زيادة أو تقليل تركيز كلوريد الصوديوم ومقارنة الاستجابة المستهدفة بالاستجابة الفارغة.

استخدم تركيز كلوريد الصوديوم الذي يوفر أكبر فرق استجابة. راقب أو قم بقياس استجابة الاختبار بعد 150 ثانية من إضافة كلوريد الصوديوم. تحليل الامتصاص عند 650 نانومتر و530 نانومتر، باستخدام مقياس طيفي.

رسم النتائج كنسبة الامتصاص عند 650 نانومتر و530 نانومتر كدالة لتركيز التحليل. تطبيع استجابة الاختبار للإشارة الفارغة. جهز مكونات اختبار جسيمات الأبتامر-الذهب النانوية كما هو موضح سابقا في الفيديو.

اصنع محاليل منفصلة تحتوي على جرام واحد لكل ملليلتر من التريهالوز وجرام واحد لكل ملليلتر من السكروز في ماء خال من النوكلياز لصنع محلول التبريد. لذا فإن خطوة حاسمة في تجميد هذه الاختبارات هي تحديد كمية المحاليل من التريهالوز والسكروز التي يجب إضافتها إلى العينات لضمان تجميد إجمالي ومتساوي. اصنع محلولا يحتوي على 19.2 ملليغرام لكل ملليلتر من التريهالوز و4.8 ملليغرام لكل ملليلتر من السكروز باستخدام اختبار 60 MN4 DNA لكل جسيم نانوي ذهبي بحجم نهائي 200 ميكرولتر في أنابيب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليتر.

ستختلف تركيزات محلول التجميد النهائي حسب تغطية الحمض النووي. قم بتجميد العينات بسرعة باستخدام فريزر بدرجة حرارة 146 درجة مئوية أو في النيتروجين السائل. احتفظ بالعينات مجمدة حتى الاستخدام.

لهذا العمل، اترك العينات في فريزر 146 درجة مئوية طوال الليل ثم انقلها إلى فريزر بدرجة حرارة 20 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد. موضحة هنا نتائج تمثيلية لمنحنيات معايرة كلوريد الصوديوم للجسيمات النانوية الذهبية غير المعالجة والمعالجة بأبتامر الحمض النووي. تم تحديد التركيز الأولي لكلوريد الصوديوم المستخدم في الاختبار عن طريق المعايرة.

تعرض هنا النتائج التمثيلية لاختبار جسيمات الذهب النانوية اللونية للكوكايين والجزيئات الضابطة. تكشف الرسوم البيانية عن تأثير زيادة كثافة تغطية الحمض النووي على معدل الاستجابة الإيجابية الكاذبة لاختبار الكوكايين. موضحة هنا مخططات منحنى المعايرة التي تم الحصول عليها من تحليل الصور الضوئية لاختبار الكوكايين اللوني.

الصور التي تم الحصول عليها باستخدام الهواتف الذكية. تعرض هنا نتائج تمثيلية لاستجابة الاختبار لاختبار جسيمات الأبتامر-الذهب النانوية اللونية على الكوكايين وجزيئات التحكم. تقارن البيانات بين العينات المحضرة حديثا والعينات المخزنة مجمدة لمدة تصل إلى أربعة أسابيع.

أثناء محاولة هذا العملية، من المهم جدا تحديد التركيز المناسب لكلوريد الصوديوم لزعزعة جسيمات الذهب النانوية وتعزيز التغير اللوني المعتاد عند إضافة الهدف. لذا بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطوير اختبارات اللونية لأبتامر الجسيمات النانوية للذهب لاكتشاف الأهداف المعنية. يمكنك استخدام الأساليب الموضحة هنا لتقليل معدلات الرد الإيجابي الكاذب والحفاظ على اختباراتك فعالة لأكثر من شهر.