سرعة التحقق من صحة ترمينتورس استخدام الموارد الوراثية النباتية الأزرق البلازميد والجمعية جولدن جيت

العام لبروتوكول البيولوجيا التركيبية هو تحديد وظيفة المنهي بسرعة وتحديد قوة المنهي في نظام مختبري يستخدم مجموعة البوابة الذهبية. يستخدم هذا البروتوكول لاختبار الإنهاء التي وجدناها في السيليكو باستخدام المعلوماتية الحيوية واختبارها في بيئة بيولوجية. يسمح هذا بالتأكيد السريع والبسيط للنهي المحددة بالمعلومات الحيوية في إعداد مقعد المختبر.

الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي سرعته. يمكننا الانتقال من تحديد المعلوماتية الحيوية إلى التأكيد البيولوجي في أقل من أسبوع واحد. وبذلك ، يمكننا أيضا التحقق من أن المنهي هو في الواقع فاصل ويمكننا تحديد قوة إنهاءه.

بشكل عام ، سيعاني الأفراد في البداية من هذه التقنية ، لأنه يبدو من غير المنطقي إضافة إنزيم التقييد مع ليغاز في نفس الأنبوب. ومع ذلك ، فإننا نستخدم نوكليازات تقييد من النوع 2S وموقع التعرف على الإنزيم منفصل عن موقع القطع الفعلي. بمجرد ربط المنهي بالبلازميد الأزرق pGR ، يكون هذا ربطا دائما.

ومع ذلك ، من خلال وجود الإنزيم المقيد والليجاز في نفس الأنبوب ، والمرور بدورات متعددة ، يمكننا تحقيق كفاءة إغلاق عالية. ابدأ هذا الإجراء بإعادة تعليق قليل النوكليوتيدات الفردية في الماء الخالي من النوكلياز بتركيز 100 ميكرومولار ، ثم قم بإعداد مخزن مؤقت للتلدين 10x. بعد ذلك ، قم بتسمية أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملم لكل فاصل يتم اختباره.

أضف إلى كل أنبوب 16 ميكرولترا من الماء فائق النقاء ، و 2 ميكرولتر من محلول التلدين 10x ، و 1 ميكرو لتر لكل من أوليجونوكوتيدات الخيط العلوي والسفلي من المنهيات المطلوبة. من المهم جدا التأكد من أن أوليجونوكوتيدات التي طلبتها لها نهايات لزجة صحيحة. لأنه بمجرد صلبهما معا ، من المهم التأكد من أن المنهي في الاتجاه الصحيح.

إذا كان المنهي في الاتجاه الخاطئ ، فلن يتمكن pGR blue من التحقق مما إذا كان جهاز إنهاء يعمل. بعد ذلك ، ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في عوامة واغليها لمدة أربع دقائق في حمام مائي. بعد أربع دقائق ، قم بإيقاف تشغيل لوح الحرارة ولكن اترك الأنبوب في الماء طوال الليل ليبرد ببطء.

قم بتخزين الفاصلات الملدنة على حرارة 20 درجة مئوية. لعمل تخفيف 40 نانومولار للفاصلات الملدنة ، قم أولا بإذابة الثلج على الجليد ، ثم في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مليلتر ، أضف 124 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز ، إلى 1 ميكرولتر من الفاصلات الملدنة. الطرد المركزي العينات لمدة 30 ثانية عند 10 ، 000x g.

بعد الدوران ، قم بتخزين العينات على الجليد. في أنبوب جديد مناسب للتدوير الحراري ، أضف 6 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. ثم أضف ميكرولتر واحد من المخزن المؤقت لغاز الحمض النووي التجاري.

قم بتنفيذ جميع الخطوات اللاحقة على الجليد. بعد ذلك ، أضف 1 ميكرولتر يحتوي على 35 إلى 50 نانوغرام لكل ميكرولتر من بلازميد الوجهة الأزرق pGR ، و 1 ميكرولتر من 40 نهايات صلبة نانومولار ، و 0.5 ميكرولتر من نوكلياز تقييد BSA1 التجاري عالي الدقة ، و 0.5 ميكرولتر من DNA ligase التجاري. الطرد المركزي خليط التفاعل عند 10 ، 000 × جم لمدة 120 ثانية.

ثم ضع الأنبوب مباشرة في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل البرنامج التالي. 20 دورة مدة كل منهما دقيقة واحدة عند 37 درجة مئوية ، تليها دقيقة واحدة عند 16 درجة مئوية ثم دورة واحدة مدتها 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد التشغيل ، قم إما بتجميد العينات وتخزينها عند 20 درجة مئوية ، أو انتقل على الفور إلى التحويل.

تحويل تفاعلات الربط إلى خلايا الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا باستخدام أي بروتوكول تحويل مناسب. هنا ، يتم تحويل خلايا JM109 باستخدام التحويل الرشيق.

باستخدام عصا هوكي زجاجية على شكل حرف L ، انشر 25 ميكرولترا من الخلايا المحولة على ألواح أجار LB الدافئة مسبقا والتي تحتوي على 1 مللي مولار أمبيسلين و 10 مللي مولار أرابينوز. احتضان الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية. لا تحتضنهم لأكثر من 24 ساعة.

يتحلل الأمبيسلين بسرعة. في اليوم التالي ، افحص لون المستعمرات. يجب أن يكون الربط الناجح أبيض أو أصفر في الضوء المرئي ، وسوف يتألق باللون الأخضر تحت الضوء الأزرق أو الأشعة فوق البنفسجية.

سينتج عن الربط غير الناجح مستعمرة زرقاء اللون تحت الضوء المرئي. لكل من المحطات وأدوات التحكم ، قم بإعداد أنبوب اختبار يحتوي على 5 ملليلتر من مرق LB المعقم مع 1 مللي مولار أمبيسلين و 10 مللي مولار أرابينوز. عند تنفيذ هذا البروتوكول ، مع pGR ، من المهم حقا التأكد من وجود الضوابط المناسبة.

يجب أن يكون عنصر التحكم الأول هو مرق LB فقط. يجب أن يكون عنصر التحكم التالي هو الخلايا التي تقاوم الأمبيسلين ، ولكنها لا تتألق تحت الضوء الأزرق. هذه ستكون بمثابة فراغ.

عنصر التحكم التالي هو بلازميد pGR الذي لم يتم قطعه لذلك لا يحتوي على جهاز إنهاء في مكانه وسيكون هذا بمثابة خط الأساس لقوة المنهي وسيكون آخر أنبوب لعينتك. تحت الضوء المرئي ، استخدم حلقة معقمة لاختيار 2 إلى 3 مستعمرات بيضاء أو صفراء ، ونقلها إلى مرق LB. اسمح للعينات بالتحتضن على شاكر عند 37 درجة مئوية عند 160 دورة في الدقيقة لمدة 16 إلى 18 ساعة.

في اليوم التالي ، استخدم مقياس الطيف الضوئي لتحديد كثافة الخلايا الضوئية لكل عينة عند 600 نانومتر. وبصفة عامة، بعد هذا القدر الزمني، يتوقع حدوث OD 600 من 0.8 إلى 1.0. ضع صفيحة بئر معقمة 96 في الغطاء.

لكل عينة أو عنصر تحكم ، قم بإعداد 3 آبار مع 199 ميكرولتر من مرق LB المعقم مع الأمبيسلين والأرابينوز. بعد ذلك ، قم بإخراج 1 ميكرولتر من محلول الخلية من المرق الليلي إلى الآبار الفردية للوحة البئر 96. املأ الأطباق بغطاء مسامي ثم رجها لمدة 18 إلى 20 ساعة عند 37 درجة مئوية و 160 دورة في الدقيقة.

في اليوم التالي ، استخدم قارئ لوحة لتحديد OD 600 ، والذي يجب أن يكون حوالي 0.5. أيضا ، قم بقياس مضان G of P بطول موجي إثارة يبلغ 395 نانومتر وانبعاث 509 نانومتر. قم بقياس مضان RFP بطول موجة إثارة يبلغ 575 نانومتر وانبعاث 605 نانومتر.

باستخدام Excel ، قم بتطبيع التباين في النمو بقسمة الإزهار على OD 600. بعد التطبيع ، حدد قوة الإنهاء النسبية عن طريق أخذ مضان إنهاء GFP على مضان التحكم في GFP وتقسيمها على مضان إنهاء RFP على مضان التحكم في RFP. تم تحليل الإنهاء المفترض T1 من خلال 6 تم تحديده بالمعلوماتية الحيوية في عاثية البكتيريا الدقيقة bernal 13 كما هو موضح في هذا الفيديو.

تظهر هذه النتائج التألق النسبي. تم تطبيع جميع النتائج باستخدام الخلايا التي تحتوي على PGR غير مقطوعة وغير معدلة كعنصر تحكم. تم العثور على T3 ليكون فاصلا قويا.

تمثل جميع النتائج مستعمرات فردية نمت في ثلاث نسخ ومتوسطها للتمثيل البصري. تمثل أشرطة الخطأ الانحرافات بين متوسط نقاط البيانات. ولتحديد أفضل تحكم مرجعي لقياس شدة الإنهاء كميا، تمت مقارنة البيانات الأولية باستخدام بلازميد pGR الأصلي الذي لا يحتوي على جهاز إنهاء ونسخة زرقاء pGR بتسلسل معروف بأنه غير أنهي.

كما يتضح هنا ، أظهر كلا الضابطين مستويات متشابهة من تعبير GFP و RFP ، والأهم من ذلك ، أنتجوا نسب GFP إلى RFP مماثلة. تمثل كل هذه النتائج مستعمرات فردية نمت ثلاث نسخ ومتوسطها للتمثيل البصري. بمجرد إتقانها ، يمكن أن تستغرق هذه التقنية أقل من 72 ساعة بما في ذلك وقت الشحن والطلب.

من المهم ملاحظة أن pGR الأزرق يعمل فقط في e.coli. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأننا ننظر فقط إلى جزء صغير من المنهي ، فليس لدينا أي فكرة عن العناصر التنظيمية الأخرى التي قد تتحكم في النسخ. للتحقق من النتائج التي تحققها باستخدام هذا البروتوكول باستخدام pGR blue ، يمكن استخدام طرق إضافية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن قطع ملحق pGR وربطه في بلازميد من اختيارك.