الحمض النووي الريبي في وقت واحد استخراج من الرواسب الساحلية والكمي ل16S الجينات الريباسي والنصوص التي في الوقت الحقيقي PCR

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي عالي الغلة والجودة من الرواسب البحرية الساحلية وبالتالي تحديد جينات ونسخ الحمض النووي الريبي الريبوسومي 16S. هذه الطريقة التي تصف استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي من الرواسب البحرية متبوعة بتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي هي خطوة رئيسية في التحليل الجزيئي لوفرة الميكروبات وتنوعها في البيئة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها لاستخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي من نفس العينة والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتحليل المصب ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي.

سيوضح الإجراء الدكتور إنريكو تاتي من NUI Galway ، ودنكان سويني ، طالب دكتوراه من جامعة إسيكس. لاستخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي من الرواسب الساحلية بعد تحضير المواد الخالية من الحمض النووي الريبي وجمع عينات الرواسب الساحلية وفقا لبروتوكول النص ، قم بنقل 0.5 جرام من الرواسب إلى أنبوب تحلل حبة سعة ملليلترين. أضف 500 ميكرولتر من مخزن الفوسفات CTAB و 500 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل إلى الأنبوب واقلبها من خمس إلى 10 مرات لتجانس العينة.

الدوامة بأقصى سرعة لمدة 2.5 دقيقة قبل أن تدور عند 16،000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ثم ، في غطاء الدخان ، استخرج الطبقة المائية العلوية وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم جديد سعة 1.5 مل. بعد ذلك ، ضع العينات على الثلج وأضف 500 ميكرولتر من الكلوروفورم المثلج:كحول الأيزواميل.

ثم اقلب الأنبوب عدة مرات حتى يصبح المستحلب مرئيا وجهاز الطرد المركزي كما كان من قبل. في غطاء الدخان ، استخرج الطبقة المائية العلوية وضعها في أنبوب معقم جديد سعة 1.5 مل. بعد ذلك ، لترسيب الأحماض النووية ، أضف مجلدين من محلول كلوريد الصوديوم PEG 30٪ واخلطه جيدا.

احتضن على الجليد لمدة ساعتين ، أو اترك العينات عند أربع درجات مئوية طوال الليل. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 16 ، 000 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. باستخدام ماصة دقيقة ، قم بإزالة المادة الطافية برفق ، مع التأكد من عدم إزعاج الحبيبات.

اترك ما يقرب من 10 ميكرولتر من محلول PEG في الأنبوب وأضف ملليلتر واحد من المثلج البارد 70٪ الإيثانول. بعد تدوير العينة ، استخدم ماصة دقيقة لإزالة الإيثانول ببطء ، مع الحرص على عدم لمس الحبيبات. ثم جهاز الطرد المركزي لمدة خمس ثوان وإزالة الإيثانول المتبقي.

اترك الحبيبات تجف في الهواء لمدة خمس دقائق قبل استخدام 50 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC لإعادة تعليقها. Aliquot عينة 15 ميكرولتر للحمض النووي و 30 ميكرولتر للحمض النووي الريبي. تتمثل الخطوة الأكثر أهمية في التأكد من عدم إزاحة حبيبات الحمض النووي / الحمض النووي الريبي أثناء إزالة المادة الطافية وعدم وجود بقايا من الإيثانول قبل تعليق الحبيبات في الماء ، حيث يمنع التفاعل الجزيئي في اتجاه مجرى النهر.

لهضم الحمض النووي في عينة الحمض النووي الريبي ، أضف ثلاثة ميكرولترات من المخزن المؤقت DNase I و 1.5 ميكرولتر من DNase I إلى 30 ميكرولتر من الحمض النووي. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. امزج كاشف تعطيل DNase عن طريق الدوامة لمدة 30 ثانية.

ثم أضف 4.8 ميكرولتر من المحلول إلى العينة واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، مع النقر أحيانا على قاع الأنابيب لخلط المحلول. بعد تدوير العينة ، انقل المادة الطافية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي إلى أنبوب جديد ، مع الحرص على عدم نقل المرسب. للتحقق من جودة الحمض النووي الريبي ، قم بتخفيف ميكرولترين من الحمض النووي الريبي ، واحد من كل 10 ، عن طريق إضافة 18 ميكرولترا من الماء المعقم منزوع الأيونات الخالي من RNase.

في تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل المنفصلة ، أضف ميكرولتر واحدا من التخفيف الأنيق أو واحد من كل 10 من الحمض النووي الريبي إلى أنبوب PCR معقم سعة 0.5 ملليلتر. باتباع الجدول الموجود في بروتوكول النص ، أضف مكونات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم جين الحمض النووي الريبي الريبوزومي 16S. قم بتضمين التحكم الإيجابي ، والتحكم في مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والتحكم السلبي.

ثم قم بتشغيل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام معلمات التضخيم التالية. لتوليد أول حبلا (كدنا) من الحمض النووي الريبي ، أضف كواشف التفاعل إلى أنبوب PCR سعة 0.2 مليلتر وفقا لبروتوكول النص. احتضان العينات عند 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

ثم ضع العينات على الجليد لمدة دقيقة واحدة على الأقل قبل احتضانها عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، أضف الكواشف في الجدول المدرج هنا من بروتوكول النص واحتضن عند 55 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة. ثم قم بتعطيل التفاعل عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

بعد إنشاء معايير الحمض النووي والحمض النووي الريبي ل qPCR وفقا لبروتوكول النص ، قم بإذابة عينات الحمض النووي والحمض النووي (cDNA) البيئية والمعايير وكواشف qPCR على الجليد. خفف معايير الحمض النووي وقم بإعداد واحد من كل 10 تخفيفات من الحمض النووي البيئي و (كدنا) من أنيق إلى 10 إلى ناقص ثلاثة. اصنع مزيجا رئيسيا لإجمالي عدد التفاعلات بالإضافة إلى 10٪ واخلطها جيدا.

أضف 19 ميكرولترا من المزيج الرئيسي وميكرولتر واحد من القالب في ثلاث نسخ لكل بئر في لوحة qPCR بصرية 96 جيدا. استخدم غطاء بصري qPCR لتغطية اللوحة. ثم قم بالطرد المركزي للوحة لفترة وجيزة وتحميلها في كتلة التسخين لجهاز qPCR.

بعد ذلك ، افتح برنامج مدير qPCR ، ثم انقر فوق علامة التبويب البروتوكول ، وانقر فوق إنشاء جديد ، وأضف شروط التضخيم التالية. اضبط حجم العينة على 20 ميكرولتر ، وانقر فوق موافق ، واحفظ البروتوكول. اختر الآن ملف لوحة التبويب.

ثم ضمن تحرير المحدد، انقر فوق تحديد الفلوروفور. أضف صبغة المراسل للمسبار المناسب وانقر فوق موافق. قم بتمييز الآبار التي تحتوي على المعايير، ثم من قائمة نوع العينة، حدد قياسي. اختر Replicate Series لتغيير حجم النسخ المتماثل إلى ثلاثة وانقر فوق Apply.

اختر سلسلة التخفيف لإضافة تركيز البداية المحسوب للتركيز القياسي. حدد عامل التخفيف 10، وحدد تقليل أو زيادة حسب الترتيب الذي تمت فيه إضافة المنحنى القياسي إلى اللوحة، وانقر فوق تطبيق. قم بتمييز مواضع البئر التي تحتوي على عينات غير معروفة وحدد غير معروف من القائمة المنسدلة نوع العينة.

اختر تكرار السلسلة وقم بتغيير حجم النسخ المتماثل إلى ثلاثة، ثم انقر على تطبيق. ضمن اسم العينة، قم بتحرير أسماء العينات، وكرر الإجراء لعدم وجود آبار تحكم في القالب. ثم ، في مربع محرر اللوحة ، انقر فوق موافق واحفظ الملف.

ثم انقر فوق بدء التشغيل. عند اكتمال التشغيل، اختر علامة التبويب القياس الكمي لعرض المنحنى القياسي وواصفات المنحنى القياسية ومخططات التضخيم. أخيرا ، اختر علامة التبويب بيانات القياس الكمي لقيم Cp وكمية البداية المقابلة لجينات العينات غير المعروفة.

تحديد عدد النسخ الجينية لكل جرام من رواسب الوزن الرطب وفقا لبروتوكول النص. كما هو موضح في صورة الهلام هذه ، ينتج عن استخراج الحمض النووي الناجح نطاقات الحمض النووي والحمض النووي الريبي الواضحة حيث تظهر نطاقات الحمض النووي الريبي الريبوزومي الحادة 23S و 16S بالإضافة إلى وجود نطاق DNA جيني عالي الوزن الجزيئي. يوضح هذا الشكل أنه عندما يتم إعداد نطاق تخفيف عشرة أضعاف وتضخيمه بشكل صحيح لإنشاء منحنى قياسي لاستخدامه في تفاعل qPCR ، يظهر فرق دورة 3.3 بين كل تخفيف قياسي.

من المهم الإبلاغ عن نقاط التقاطع، أو قيم Cp، من عنصر تحكم عدم وجود قالب، أو NTC، إن وجد. وفي حالة حدوث ذلك، يفرض انقطاع Cp للعينات القياسية وغير المعروفة من 3.3 دورات أو طية لوغاريتمية أعلى من قيمة Cp للحاوية الوطنية على النحو الموصوف سابقا. هنا ، تم تضخيم العينة البيئية من أنيق ، 10 إلى سالب واحد ، 10 إلى سالب اثنين ، و 10 إلى ناقص ثلاثة تخفيفات.

لم تتضخيم العينة الأنيقة وكانت قيم Cp من 10 إلى سالب واحد إلى 10 إلى سالب ثلاثة تخفيفات 24.12 و 26.02 و 28.40 على التوالي. كما هو موضح في هذا الرسم البياني ، فإن واصفات المنحنى القياسية ، بما في ذلك قيم R التربيعية البالغة 0.99 وكفاءات تفاعل البوليميراز المتسلسل في نطاق 90 إلى 110٪ مطلوبة. في هذه التجربة ، كان NTC Cp 30.5 ، وتم فرض قطع Cp سلبي قدره 27.2.

تحويل وفرة الجينات إلى لكل جرام من رواسب الوزن الرطب إلى 2.5 في 10 إلى السابع و 7.1 في 10 إلى السابع ل 10 إلى سالب واحد و 10 إلى سالب اثنين من التخفيفات على التوالي. كان Cp المخفف 10 إلى ناقص ثلاثة أكبر من قطع NTC. في هذه الحالة ، تم تحديد 10 إلى سالب اثنين كتخفيف مثالي للقالب.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الحمض النووي الريبي يمكن أن يتحلل بسرعة ، لذلك من المهم الاحتفاظ بالعينة على الجليد واستخدام القفازات لتجنب التلوث ب RNase طوال الوقت. لا تنس أننا نعمل مع الفينول: الكلوروفورم وكحول الإيزميل ، وقد يكون ذلك خطيرا للغاية. ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معطف المختبر والقفازات والنظارات الواقية والعمل تحت غطاء كيميائي أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي وتحديد وفرة الجينات والنسخ في الرواسب الساحلية البحرية. تذكر أنه يمكن استخدام هذا الإجراء بسهولة لاستخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي وتحديد مجموعة من الأهداف الجينية من معظم العينات البيئية ، بما في ذلك التربة.