جيل من الخلايا الجذعية المستحثة-المحفزة عن طريق Synoviocytes الخلايا الليفية مثل المعزولة من المفاصل من التهاب المفاصل الروماتويدي المرضى

الهدف العام من هذه التجربة هو توليد خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات ، أو IPCs ، من الخلايا الغشاء الزليلي الشبيهة بالخلايا الليفية المعزولة من الأنسجة الزليلية للمفصل الملتهب بالتهاب المفاصل الروماتويدي. حاليا, يمكن إنشاء iPSC من مختلف الخلايا الأولية البشرية. نجحنا في توليد iPSC من الخلايا الغليلية الشبيهة بالخلايا الليفية البشرية ، وهي الخلايا المرضية الرئيسية للمفاصل الروماتويدية.

قد يساعد هذا في التحقيق في أمراض التهاب المفاصل الروماتويدي. يمكن أن تساعد هذه الدورية في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول تنكس IPSC ، باستخدام RA-FLSs. ابدأ بوضع الأنسجة الزليلية في طبق 100 ملم وغسل الأنسجة ب 5 ملليلتر من PBS مكملة بالمضادات الحيوية.

قم بإزالة الأنسجة الدهنية الصفراء وبقايا العظام. ثم انقل الأنسجة المشذبة إلى بئر واحد من ستة ألواح بئر تحتوي على 5 ملليلتر من DMEM مكملة ب FBS واستخدم المقص لفرم الأنسجة حتى تصبح القطع صغيرة بما يكفي لاختراق طرف الماصة القابل للتصرف انقل الوسط إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ، ثم أضف 5 ملليلتر من DMEM الطازج بالإضافة إلى FBS إلى البئر لجمع أي أنسجة متبقية ونقل محتويات البئر بالكامل إلى الأنبوب.

بعد ذلك ، أضف الكولاجيناز المذاب بالثلج إلى التركيز النهائي بنسبة 0.01٪ إلى الأنبوب وأغلق الأنبوب بالبارافيلم للحضانة في حمام مائي 37 درجة مئوية مع الاهتزاز. بعد أربع ساعات ، املأ الأنبوب ب DMEM الطازج بالإضافة إلى FBS إلى الحجم النهائي البالغ 50 مل واجمع شظايا الأنسجة عن طريق الطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات ثم أعد تعليق الخلايا في 40 مل من الوسط الطازج لطرد مركزي آخر.

أعد تعليق الحبيبات الثانية في 25 مليون من DMEM الطازج بالإضافة إلى FBS والسماح للكتل الكبيرة من الأنسجة بالاستقرار. ثم انقل المادة الطافية إلى طبق جديد بحجم 100 ملم واحتضان الخلايا الغليلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 14 يوما. لتوسيع ثقافة الخلايا الغليلية ، تخلص من الوسط المستخدم واغسل الخلايا في 5 مل من PBS.

قم بإزالة PBS وفصل الخلايا مع 1 ملليلتر من EDTA في حاضنة زراعة الخلايا لمدة دقيقتين. في نهاية الحضانة ، اضغط على الطبق برفق لفصل أي خلايا ملتصقة متبقية ونقل تعليق الخلية الناتج إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر للطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في 30 مل من DMEM و FBS وقسم الخلايا إلى 3 أطباق جديدة 100 ملم.

قم بتغذية الخلايا الغليلية بوسط طازج كل 3 أيام ، وتقسيم الخلايا إلى 3 مزارع جديدة عند التقاء 80٪ كما هو موضح للتو. في يوم التنبيغ صفر ، انظر 3 × 10 إلى 4 FLS لكل بئر على صفيحة 6 آبار في وسط نمو جديد لحضانة ليلية عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2. في اليوم التالي ، قم بإذابة قارورة واحدة من فيروس لينتي تحتوي على 4 عوامل ياماناكا عند 4 درجات مئوية واستبدل وسط استزراع FLS بوسط نمو FLS مكمل ببروميد سداسي ديميثرين وحمض الأسكوربيك.

عندما تذوب محتويات القارورة ، أضف 30 ميكرولترا من فيروس العدسات إلى الخلايا واخلطها برفق لتوزيع الفيروس بشكل متجانس. لتحسين العدوى ، قم بالطرد المركزي للوحة وإعادة الخلايا إلى الحاضنة لاستبدال الوسط كل يوم بوسط نمو FLS طازج يحتوي على زبدات الصوديوم وحمض الأسكوربيك لمدة 3 أيام. في اليوم الرابع, استبدال الوسط بمزيج من نمو FLS ووسط iPSC يحتوي على زبدات الصوديوم وحمض الأسكوربيك.

في اليوم 5 ، أضف 60 ميكرولترا من الفيترونكتين إلى 6 ملليلتر من PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم وقم بتغطية 3 آبار من صفيحة 6 آبار مع 2 مل من المحلول لمدة ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. أثناء إعداد الفيترونكتين ، اغسل الخلايا المنقولة باستخدام PBS وافصلها باستخدام EDTA كما هو موضح. بعد جمع الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي ، أعد تعليق الحبيبات في 900 ميكرولتر من الوسط الطازج.

قم بإزالة الفيترونكتين الزائد من الآبار وأضف 300 و 150 و 100 ميكرولتر من الخلايا في الآبار الفردية. ثم أعد الخلايا إلى الحاضنة, استبدال الوسط يوميا مع الوسط iPSC جديدة حتى تظهر المستعمرات. لاختيار المستعمرات ، أضف أولا 500 ميكرولتر من وسيط iPCS ، مع مثبط ROCK إلى كل بئر من لوحة 48 بئر مطلية بفيتامين البكتين.

بعد ذلك ، ضع مزارع FLS تحت مجهر تشريح على مقعد نظيف ، واستخدم طرف ماصة سعة 10 ميكرولتر لقطع مستعمرة ذات أهمية. باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر ، انقل المستعمرة المقطوفة إلى بئر واحد من صفيحة 48 بئر. عندما يتم قطف جميع المستعمرات ، ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا حتى تصبح المستعمرات كبيرة بما يكفي للنقل.

تقسيم الخلايا عندما تكون المستعمرات خارج المجال المرئي للمجهر ، كما هو موضح عند تكبير 100X. في هذه الصورة ، يمكن ملاحظة مورفولوجيا FLS المعزولة بعد ثقافة أولية مدتها 14 يوما. تظهر الخلايا خصائص الخلايا الليفية بشكل عام مع تعبير مماثل عن العلامات الليفية فيمنتين وفيبرونيكتين بالإضافة إلى تعبير منخفض عن علامة الخلايا الغليلية الشبيهة بالبلاعم CD-68.8 إلى 11 يوما بعد انتقال فيروس العدسات لعامل ياماناكا ، تبدأ المستعمرات الصغيرة في الظهور والتي يمكن قطفها وتضخيمها لمدة 5 إلى 10 مقاطع.

هذه التهاب المفاصل الروماتويدي iPSC التعبير عن الفوسفاتيز القلوي مما يشير إلى أنها لا تزال غير متمايزة. تعبر الخلايا أيضا عن علامات متعددة القدرات كما أكدها RT-PCR وتحليل التألق المناعي. تظهر iPCS لالتهاب المفاصل الروماتويدي نمطا كروموسوماتيا طبيعيا يبلغ 44 + XY كما هو محدد بواسطة التنميط النووي.

فورثر, بعد 12 أسبوعا من حقنهم في الفئران SCID, التهاب المفاصل الروماتويدي iPSC شكلت ورم مسخي, التي تعرض أنماط ظاهرية متنوعة للأنسجة. مع تأكيد تمايز الطبقة الجرثومية عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي. بمجرد إتقانها, يمكن إنشاء iPSC من FLSs مع الغشاء الزليلي.

بعد مشاهدة الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم أفضل لكيفية العزل عن الأنسجة الزليلية وكيفية تحفيز إعادة البرمجة باستخدامها. يمكن أن تكون iPSC المشتقة من RAF-FLS مفيدة لدراسة التجديد أو فحص الأدوية في أمراض الروماتيزم. بمجرد إنشاء هذه iPSC, يمكن إنشاء أنواع مختلفة من الخلايا أو الأجهزة المستهدفة.

والتي قد تكون مفيدة لدراسة المرض أو التطبيقات المستقبلية الأخرى ، مثل تحرير الجينات وما إلى ذلك.