العزلة والخلوية Phenotyping من الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع الزلالية السائل والعظام من Minipigs

الهدف العام من هذا الإجراء هو الجمع غير الجراحي للسائل الزليلي ونخاع العظم من الخنازير الصغيرة لجمع الخلايا الجذعية الوسيطة لاستخدامها في دراسات التجديد والتعديل المناعي. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علاج الخلايا الجذعية الوسيطة في طب الأذن، مثل كيفية استخلاص الخلايا الجذعية الوسيطة من السائل الزليلي، وكيفية توصيفها مقارنة بالخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظم. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في التحديد الفعال للخصائص الأساسية للخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من السائل الزليلي ونخاع العظم في الخنازير الصغيرة، مما سيكون مفيداً للتطبيق على المرضى.

تمتد تداعيات هذه التقنية نحو علاج مختلف أمراض المفاصل، لأن تعداد الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) المشتقة من السائل الزلالي في التجويف الزلالي يزداد بشكل ملحوظ لدى المرضى الرياضيين. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى في الطب التجديدي، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً في دراسات أخرى مثل أبحاث أمراض المناعة الذاتية. ونظراً لأن الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) في الخنازير الصغيرة هي خلايا ذاتية، فقد يكون تثبيط المناعة محل اهتمام البشر.

بالإضافة إلى العلماء الآخرين، سيقوم Hyeon-Jeong Lee و Won-Jae Lee من المستوى الثالث بتوضيح الإجراء. للبدء، يتم توجيه خنزير صغير مخدّر للوصول إلى العرف الحرقفي. بعد ذلك، يتم إزالة الشعر من منطقة تبلغ مساحتها 15 square centimeter على العرف الحرقفي، باستخدام شفرة حلاقة أو مقص شعر.

بعد ذلك، قم بفرك الجلد المكشوف بالتناوب ثلاث مرات باستخدام بوفيدون-يود وإيثانول 70%. وبمجرد أن يجف تماماً، ضع الشراشف المعقمة. الآن، قم بطلاء محقنة سعة 10 mL مسبقاً بالهيبارين، باستخدام شطف بمقدار 3 إلى 4 mL.

سيمنع هذا تخثر نخاع العظم أثناء استخلاصه. بعد ذلك، وعند قمة العظم الحرقفي تحديداً، قم بتثبيت مستخرج نخاع العظم بإحكام في سرنجة مطلية بالهيبارين، واستخلص 5 milliliters على الأقل من نخاع العظم. ولعزل الخلايا من نخاع العظم المستخلص، قم أولاً بتخفيفه بحجم مساوٍ من DPBS في أنبوب مخروطي سعة 15-milliliter في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، قم بتحميل 3 mL من وسط الطرد المركزي الكثافي في أنبوب مخروطي ثانٍ سعة 15 mL. ثم انقل بعناية 4 mL من نخاع العظم المخفف فوق وسط الطرد المركزي الكثافي لتكوين طبقتين من المحاليل. الآن، قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 400 Gs لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

يتم تجميع الخلايا أحادية النواة (MNCs) المطلوبة في الطبقة البيضاء المركزية. قم بسحب هذه الطبقة فقط. ثم قم بتفريغ طبقة الخلايا أحادية النواة في أنبوب مخروطي سعة 15-milliliter، وقم بتخفيفها باستخدام سبعة إلى ثمانية milliliters من DPBS.

بعد ذلك، يتم طرد الخلايا مركزياً عند 500 Gs لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من السائل الطافي، واغسل الخلايا المترسبة مرتين باستخدام عشرة ملليلتر من DPBS، مع تكرار دورة الطرد المركزي السابقة. وبعد الغسلتين، نقوم بتعليق MNCs في مليليلترين من ADMEM.

بعد ذلك، يتم تحميل الخلايا في طبق زراعة أنسجة بقطر 35 ملم، وتُحضن عند درجة حرارة 38.5 °C في حضانة رطبة تحتوي على 5% carbon dioxide. بعد مرور 48 ساعة، يتم سحب الوسط الغذائي مع الخلايا أحادية النواة (MNCs) غير الملتصقة. ثم يُضاف 2 mL من وسط ADMEM الطازج، ويستمر التحضين مع تغيير الوسط الغذائي كل ثلاثة أيام.

عندما تصل الخلايا إلى درجة تلاقي تتراوح بين 70 إلى 80%، اغسل المزرعة باستخدام DPBS طازج. بعد ذلك، قم بفصل الخلايا باستخدام 1 مل من Trypsin-EDTA بتركيز 0.25% لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. اجمع الخلايا في 10 مل من ADMEM، وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.

بعد ذلك، قم بطرد الخلايا مركزياً عند 300 Gs لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتخلص من الطافي. الآن، قم بتعليق الخلايا أحادية النواة (MNCs) المحصودة في 1 mL من وسط ADMEM الطازج، وقم بقياس كثافتها. اختتم العملية بزراعة ما بين 0.5 و 0.75 مليون خلية في دوارق T25 مع 4 mL من وسط ADMEM.

قم بتحضين الدوارق تماماً كما تم فعل ذلك مع الأطباق، وقم بتغيير الوسط كل ثلاثة أيام. جهز مقطعاً من الجلد بمساحة 15x10 سنتيمتر فوق المفصل الفخذي، كما تم فعله عند التحضير لجمع نخاع العظم. بعد ذلك، قم بجس الرضفة وعرف الساق تحت الجلد لتحديد المفصل الزلالي، ثم أدخل سرنجة سعة ثلاثة ملليلتر مزودة بإبرة قياس 23-gauge بدقة داخل المفصل.

باستخدام شفط خفيف، استخلص ما بين 1/2 و1 ملليلتر من السائل، ثم اسحب الإبرة على الفور. إذا كان حجم السائل الزليلي صغيراً جداً، فقم بغسل التجويف باستخدام DPBS لجمع السائل الزليلي مع DPBS. ويختلف حجم DPBS المستخدم وفقاً لحجم التجويف الزليلي.

تكون الكمية المثالية للسائل الزليلي محدودة في المفصل السليم. وتتفاوت هذه الكمية بتفاوت حجم المفصل وحالته المرضية. لعزل الخلايا من السائل الزليلي، يتم تخفيف السائل بحجم مساوٍ من DPBS في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، نقوم بإزالة الحطام عن طريق ترشيح التخفيف باستخدام مصفاة خلايا نايلون بمسامية 40 micron. ثم، نضيف عشرة ملليلترات إضافية من DPBS، ونقوم بمركز المعلق عند 400 Gs لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، يتم التخلص من الطافي، وغسل الخلايا مرتين باستخدام DPBS.

نقوم بتعليق كتلة الخلايا المغسولة في 2 mL من ADMEM. بعد ذلك، نستمر في زراعة الخلايا كما تم توضيحه مع الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs). وقد تم عزل الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) بنجاح من نخاع العظم والمفاصل الزليلية المفصلية للخنازير القزمة وتوسيعها في المختبر (in vitro).

تتشابه مورفولوجيا الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) المشتقة من السائل الزلالي مع مورفولوجيا الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظم: حيث يتميز كلاهما بشكل مغزلي ليفي وتلتصق الخلايا بشكل متجانس. وأظهرت الخلايا الجذعية الوسيطة تعبيراً إيجابياً عن صبغة الفوسفاتاز القلوي بعد اكتمال المزرعة الفرعية الثالثة. بعد ذلك، تم تحليل العلامات السطحية في كلتا المزرعتين.

كما كان متوقعاً، أظهر كلا النوعين من الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) تعبيراً ملحوظاً عن CD29 وCD44 وVimentin. وفي المقابل، كان التعبير عن CD34 وCD45 سلبياً ومنخفضاً. وكانت هذه النتائج مطابقة لتلك التي تم الحصول عليها من خلايا جذعية ميزنكيمية مميزة، بما في ذلك الخلايا المعزولة من السائل الزليلي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية سحب السائل الزلالي ونخاع العظم بطريقة غير جراحية لعزل الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC) منها في الخنازير الصغيرة، وكيفية إجراء المقارنة والتنميط الظاهري لهذه الخلايا الجذعية الميزنكيمية. أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تحديد النقطة المستهدفة على العرف الحرقفي والمفصل الزلالي من خلال الجس الدقيق. بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى كما في نماذج الفصال العظمي أو التهاب المفاصل الروماتويدي للإجابة على أسئلة إضافية، مثل ما إذا كانت الخلايا الجذعية الميزنكيمية المستخلصة من السائل الزلالي، وليس فقط من نخاع العظم، تمتلك القدرة نفسها على تحفيز تكوين الغضاريف أو العظام وتثبيط المناعة.

ساهمت هذه التقنية بعد تطويرها في دفع عجلة العلاج الذاتي لأمراض المفاصل من خلال المساعدة في توصيف الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) المشتقة من المفاصل المصابة أو الملتهبة لدى مرضى التهاب المفاصل.