العزلة والخلوية Phenotyping من الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع الزلالية السائل والعظام من Minipigs

الهدف العام من هذا الإجراء هو الجمع غير الجراحي للسائل الزليلي ونخاع العظام من الخنازير الصغيرة لجمع الخلايا الجذعية الوسيطة لاستخدامها في دراسات التجديد والتعديل المناعي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علاج MSC لأخصائي الأذن ، مثل كيفية إنشاء السائل الزليلي في MSC ، وكيفية توصيفها بالمقارنة مع MSC لنخاع العظم. تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في تحديد الخصائص الرئيسية للسائل الزليلي والخلايا الجذعية الجذعية المشتقة من نخاع العظام بشكل فعال من الخنازير الصغيرة ، والتي ستكون مفيدة للتطبيق في المرضى.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج أمراض المفاصل المختلفة ، لأن عدد سكان MSC المشتق من السائل الزليلي في التجويف الزليلي يزداد بشكل كبير في المرضى الرياضيين. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للطب التجديدي ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على دراسات أخرى مثل أبحاث أمراض المناعة الذاتية. نظرا لأن الخلايا الجذعية الجذعية الصغيرة ذاتية المظهر ، فقد يثير تثبيط المناعة اهتمام البشر.

بالإضافة إلى العلماء الآخرين ، سيكون إثبات الإجراء هو Hyeon-Jeong Lee و Won-Jae Lee من المستوى الثالث. للبدء ، قم بتوجيه خنزير صغير مخدر للوصول إلى القمة الحرقفية. بعد ذلك ، قم بإزالة منطقة مساحتها 15 سم مربع على القمة الحرقفية باستخدام ماكينة حلاقة أو ماكينة قص.

بعد ذلك ، قم بفرك الجلد المكشوف بالتناوب ثلاث مرات باستخدام بوفيدون اليود و 70٪ من الإيثانول. بمجرد أن تجف تماما ، ضع ستائر معقمة. الآن ، قم بتغطية حقنة سعة عشرة ملليلتر مسبقا بالهيبارين ، باستخدام شطف من ثلاثة إلى أربعة ملليلتر.

سيمنع ذلك نخاع العظم من التخثر أثناء استخراجه. بعد ذلك ، على وجه التحديد عند قمة العظم الحرقفي ، قم بتوصيل مستخرج نخاع العظم بإحكام بالمحقنة المطلية بالهيبارين ، واستخرج ما لا يقل عن خمسة ملليلتر من نخاع العظام. لعزل الخلايا عن نخاع العظم المستخرج ، قم أولا بتخفيفه بحجم متساو من DPBS في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بتحميل ثلاثة ملليلتر من وسائط الطرد المركزي الكثافة في أنبوب مخروطي ثان سعة 15 ملليلترا. بعد ذلك ، انقل بعناية أربعة ملليلتر من نخاع العظم المخفف إلى وسائط الطرد المركزي الكثافة لإنشاء طبقات من محلولين. الآن ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 400 Gs لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

يتم جمع MNCs المطلوبة في الطبقة البيضاء المركزية. استنشق هذه الطبقة فقط. اخرج طبقة MNC في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر ، وقم بتخفيفها بسبعة إلى ثمانية ملليلتر من DPBS.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 Gs لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية ، واغسل الخلايا المنقولة مرتين بعشرة ملليلتر من DPBS ، مع تكرار دورة الطرد المركزي السابقة. بعد الغسلتين ، نقوم بتعليق MNCs في ملليلترين من ADMEM.

بعد ذلك ، قم بتحميل الخلايا في طبق زراعة الأنسجة 35 ملم ، واحتضانها عند 38.5 درجة مئوية في حاضنة مرطب بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد 48 ساعة ، قم بشفط الوسط مع الشركات متعددة الجنسيات غير المتصلة. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من ADMEM الطازج ، واستمر في الحضانة ، وقم بتغيير الوسط كل ثلاثة أيام.

عندما تصل الخلايا إلى 70 إلى 80٪ من التقاء ، اغسل المزرعة باستخدام DPBS الطازجة. بعد ذلك ، قم بفصل الخلايا باستخدام مليلتر واحد من 0.25٪ Trypsin-EDTA لمدة ثلاث إلى خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. اجمع الخلايا في عشرة ملليلتر من ADMEM ، وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.

بعد ذلك ، قم بتدوير الخلايا عند 300 جي لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية. الآن ، قم بتعليق الشركات متعددة الجنسيات المحصودة في مليلتر واحد من ADMEM الطازج ، وقم بقياس كثافتها. انتهي من الطلاء بين 1/2 وثلاثة أرباع مليون خلية في قوارير T25 بأربعة ملليلتر من ADMEM.

احتضن القوارير تماما مثل الألواح ، وقم بتغيير الوسيط كل ثلاثة أيام. قم بإعداد قسم من الجلد مقاس 15 × 10 سم فوق مفصل الفخذ ، كما حدث عند التحضير لمجموعات نخاع العظم. بعد ذلك ، قم بجس قمم الرضفة والساق أسفل الجلد لتحديد المفصل الزليلي ، وأدخل حقنة سعة ثلاثة ملليلتر بإبرة قياس 23 ، بدقة في المفصل.

باستخدام شفط لطيف ، استخرج ما بين 1/2 ومليلتر واحد من السائل ، واسحب الإبرة على الفور. إذا كان حجم السائل الزليلي صغيرا جدا ، فقم بغسل التجويف باستخدام DPBS لتجميع السائل الزليلي باستخدام DPBS. يختلف حجم DPBS المراد استخدامه باختلاف حجم التجويف الزليلي.

الحجم الأمثل للسائل الزليلي محدود في المفصل السليم. يختلف الحجم باختلاف حجم مفصله وحالته المرضية. لعزل الخلايا عن السائل الزليلي ، قم بتخفيف السائل بحجم متساو من DPBS في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، نقوم بتحريك الحطام عن طريق تصفية التخفيف من خلال مصفاة خلية نايلون 40 ميكرون. بعد ذلك ، أضف عشرة ملليلتر أخرى من DPBS ، وقم بالطرد المركزي للتعليق عند 400 Gs لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية ، واغسل الخلايا مرتين باستخدام DPBS.

نقوم بتعليق منصة الخلية المغسولة في ملليلترين من ADMEM. بعد ذلك ، استمر في زراعة الخلايا كما هو موضح مع الخلايا الجذعية الجذعية ، تم عزل الخلايا الجذعية الجذعية بنجاح من نخاع العظام والمفاصل الزليلية المفصلية للخنازير الصغيرة وتم توسيعها في المختبر.

يشبه مورفولوجيا الخلايا الجذعية الجذعية المشتقة من السائل الزليلي مورفولوجيا الخلايا الجذعية الجذعية المشتقة من نخاع العظام: كلاهما له شكل مغزل ليفي وملتصق بشكل متجانس. أظهرت الخلايا الجذعية الجذعية تعبيرا إيجابيا عن تلطيخ الفوسفاتيز القلوي بعد اكتمال الاستزراع الفرعي الثالث. بعد ذلك ، تم تحليل علامات السطح في كلتا الثقافتين.

كما هو متوقع ، عبر كلا النوعين من الخلايا الجذعية الجذعية بشكل كبير عن CD29 و CD44 و Vimentin. على النقيض من ذلك ، كان التعبير عن CD34 و CD45 سلبيا ومنخفضا. كانت هذه النتائج مطابقة لتلك التي تم الحصول عليها من خلال الخلايا الجذعية الجذعية المميزة ، بما في ذلك الخلايا المعزولة من السائل الزليلي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية شفط السائل الزليلي ونخاع العظام بشكل غير جراحي من أجل عزل MSC عن الخنازير الصغيرة وكيفية إجراء المقارنة والتنميط الظاهري ل MSC. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحديد موقع النقطة الموضوعية على القمة الحرقفية والزليلي ، والتي يتم تحديدها عن طريق الجس الدقيق. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى كما هو الحال في نماذج هشاشة العظام أو التهاب المفاصل الروماتويدي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كان ليس فقط من MSC للنخاع ولكن أيضا من الخلايا الجذعية الزليلية للسائل الزالي لها نفس القدرة على بدء الغضروف أو العظام وكبت المناعة.

بعد تطويرها ، طورت هذه التقنية علاجا ذاتيا لأمراض المفاصل من خلال المساعدة في توصيف الخلايا الجذعية الجذعية المشتقة من المفصل المهاجم أو الملتهب في مرضى التهاب المفاصل.